【试剂耗材笔记】细胞冻存液综述

2024-02-18

细胞冻存的意义和应用细胞冻存技术是指将活细胞在低温下保存，使其保持活力，以便在需要时取出来进行复苏。

绪论

1.1 细胞冻存的意义和应用

细胞冻存技术是指将活细胞在低温下保存，使其保持活力，以便在需要时取出来进行复苏。细胞冻存技术具有以下重要意义：

1. 保护濒危物种的细胞

2. 保存重要细胞株

3. 保存罕见或难以获得的细胞

4. 保存生物医学研究中的重要细胞

5. 保存人类和动物的细胞，以备移植之用

6. 保存细胞库，以备临床和研究之用

1.2 细胞冻存液的作用和重要性

细胞冻存液在细胞冻存过程中发挥着重要的作用，它能够在低温下保护细胞免受冰晶的损伤，并维持细胞的活性。细胞冻存液通常含有以下成分：

1. 二甲基亚砜（DMSO） ：DMSO是一种有机溶剂，可以降低细胞膜的渗透压，防止细胞因冰晶形成而破裂。

2. 胎牛血清（FBS） ：FBS含有丰富的蛋白质和生长因子，可以为细胞提供营养和保护。

3. 肝素 ：肝素是一种抗凝剂，可以防止细胞在冻存过程中发生凝集。

4. 葡萄糖 ：葡萄糖可以为细胞提供能量，并帮助细胞在复苏后恢复活力。

细胞冻存液的质量和成分对细胞的冻存效果有很大的影响。如果细胞冻存液的成分不正确或质量不达标，可能会导致细胞冻存失败或细胞复苏后存活率低。

组成

2.1 细胞冻存液的主要成分

细胞冻存液的主要成分包括：

1. 二甲基亚砜（DMSO） : DMSO是一种有机溶剂，可以降低细胞膜的渗透压，防止细胞因冰晶形成而破裂。DMSO是细胞冻存液中最常用的成分，其浓度通常在5%到10%之间。

2. 胎牛血清（FBS） : FBS含有丰富的蛋白质和生长因子，可以为细胞提供营养和保护。FBS是细胞冻存液中常用的成分，其浓度通常在10%到20%之间。

3. 肝素 : 肝素是一种抗凝剂，可以防止细胞在冻存过程中发生凝集。肝素是细胞冻存液中常用的成分，其浓度通常在10U/ml到20U/ml之间。

4. 葡萄糖 : 葡萄糖可以为细胞提供能量，并帮助细胞在复苏后恢复活力。葡萄糖是细胞冻存液中常用的成分，其浓度通常在5mM到10mM之间。

2.2 不同成分的作用与机制

二甲基亚砜（DMSO） ：DMSO可以降低细胞膜的渗透压，防止细胞因冰晶形成而破裂。DMSO还可以抑制细胞代谢，减缓细胞老化。

胎牛血清（FBS） ：FBS含有丰富的蛋白质和生长因子，可以为细胞提供营养和保护。FBS还可以吸附细胞表面的冰晶，防止细胞被冰晶损伤。

肝素 : 肝素是一种抗凝剂，可以防止细胞在冻存过程中发生凝集。肝素还可以抑制细胞表面的凝血酶，防止细胞发生血栓。

葡萄糖 : 葡萄糖可以为细胞提供能量，并帮助细胞在复苏后恢复活力。葡萄糖还可以抑制细胞凋亡，保护细胞免受损伤。

2.3 细胞冻存液的配制方法

1. 将DMSO、FBS、肝素和葡萄糖按照一定比例混合。

2. 将混合物搅拌均匀，直到所有成分完全溶解。

3. 将混合物过滤除菌。

4. 将混合物分装到无菌的冻存管中。

5. 将冻存管密封，并在管壁上贴上标签，注明细胞冻存液的成分和日期。

种类

3.1 常用的细胞冻存液类型

DMSO-培养基冻存液 ：使用二甲基亚砜（DMSO）和培养基的混合物来冻存细胞。DMSO可以有效地降低细胞冻结过程中的冰晶形成，以保护细胞免受冻结损伤。
Glycerol-培养基冻存液 ：使用甘油和培养基的混合物来冻存细胞。甘油可以提供类似DMSO的保护作用，适用于一些对DMSO敏感的细胞系。
FBS-培养基冻存液 ：使用胎牛血清（FBS）和培养基的混合物来冻存细胞。FBS提供了营养和保护细胞的因子，对某些细胞系有更好的保护效果。
细胞保存液（Cell Preservation Solution） ：一些商业化的细胞保存液可以直接用于细胞冻存，其中包括某些特殊的保护剂和缓冲液，可以提供更好的细胞存活率。
Serum-Free Cryopreservation Solution ：无血清的冻存液，可以用于细胞系冻存，并减少由血清成分引起的扰动。

3.2 不同类型细胞冻存液的优缺点

DMSO-培养基冻存液：

优点：

DMSO被广泛应用于细胞冻存，有良好的保护细胞的能力。
冻存过程中，DMSO可以降低细胞外液中的冰晶形成，减少对细胞的冻结损伤。

缺点：

DMSO有毒性，可能对某些细胞系产生负面影响。
冷冻/解冻过程中，DMSO可能对细胞造成应激和损伤。

Glycerol-培养基冻存液：

优点：

甘油是一种温和的保护剂，对细胞的毒性较低。
适用于一些对DMSO敏感的细胞系。

缺点：

甘油的保护效果可能不如DMSO，对某些细胞系的冷冻/解冻过程需求较高。

FBS-培养基冻存液：

优点：

胎牛血清（FBS）是一种丰富的营养及保护因子来源，能够提供

细胞所需的营养物质和生长因子。
对于部分细胞系，FBS作为冻存液可以提供更好的细胞存活率。

缺点：

FBS含有多种成分，其中的一些成分可能对特定的细胞系产生负面影响。
冻存液中FBS的浓度需要经过优化，否则可能导致细胞冻存和解冻的不稳定性。

4.细胞保存液（Cell Preservation Solution）：

优点：
某些商业化的细胞保存液可以提供更加稳定的冻存效果，并且简化了冻存液的制备过程。
可以包含特殊的保护剂和缓冲液，提供更好的细胞存活率。

缺点：

相对于自制的冻存液，商业化的细胞保存液可能成本较高。

3.3 选择细胞冻存液的标准

选择细胞冻存液时，应考虑以下因素：

细胞类型 ：不同的细胞类型对细胞冻存液的成分和浓度有不同的要求。

冻存时间 ：细胞冻存的时间越长，对细胞冻存液的要求越高。

复苏率 ：细胞冻存液的质量和成分对细胞的复苏率有很大的影响。

价格：细胞冻存液的价格也是一个重要的考虑因素。

使用方法

4.1 细胞冻存液的使用步骤

1. 将细胞悬液与细胞冻存液按照一定比例混合。

2. 将混合物缓慢冷却至-80℃。

3. 将混合物转移至液氮罐中长期保存。

4.2 细胞冻存液的使用注意事项

细胞冻存液应无菌。

细胞冻存液的浓度应根据细胞类型和冻存时间确定。

细胞冻存液应缓慢冷却至-80℃。

细胞冻存液应在液氮罐中长期保存。

保存和运输

5.1 细胞冻存液的保存条件

细胞冻存液应在液氮罐中保存。液氮罐的温度应保持在-196℃以下。细胞冻存液应避免反复冻融，否则会降低细胞的复苏率。

5.2 细胞冻存液的运输注意事项

细胞冻存液在运输过程中应保持低温。可以使用液氮罐或干冰箱运输细胞冻存液。细胞冻存液在运输过程中应避免剧烈震动，否则会损伤细胞。

温度：通常将细胞冻存液保存在低温条件下，最常用的是-80摄氏度的冷冻冰箱。这可以阻止细胞的代谢过程，延缓细胞老化和死亡。
冷冻液：细胞冻存液应该含有适当的冷冻保护剂，例如二甲基亚砜（DMSO）或甘油，以保护细胞免受冷冻引起的损害。
玻璃容器：细胞冻存液应该存放在无菌密封的玻璃容器中，以防止污染和水分的蒸发。
防止震动：细胞冻存液应该避免剧烈震动，因为震动可能对细胞造成损害。
包装标签：每个冻存容器都应贴上标签，标明细胞的来源、保存日期、冻存液成分等信息，以便于识别和管理。

安全性

6.1 细胞冻存液的安全性和毒性评估

细胞冻存液可能含有有毒物质，如DMSO和FBS。DMSO可能会渗透细胞膜，导致细胞内水分流失。FBS可能会含有病毒和细菌，感染细胞。因此，在使用细胞冻存液之前，应进行安全性评估，以确保细胞冻存液无毒无害。

6.2 使用细胞冻存液的安全操作规程

在使用细胞冻存液时，应严格遵守安全操作规程，以防止DMSO和FBS对人体造成伤害。

* 佩戴手套和防护服。

* 在通风良好的环境中操作。

* 避免皮肤和眼睛接触细胞冻存液。

* 操作结束后，立即用肥皂和水清洗双手。

发展趋势

7.1 细胞冻存液的新型成分和技术

目前，正在开发新型的细胞冻存液成分和技术，以提高细胞冻存的效率和安全性。

新型的细胞冻存液成分包括：

新型渗透剂 ：新型渗透剂可以降低细胞膜的渗透压，防止细胞因冰晶形成而破裂。新型渗透剂的毒性较小，对细胞的复苏率有较大的提高。

新型保护剂 ：新型保护剂可以保护细胞免受冰晶的损伤。新型保护剂的毒性较小，对细胞的复苏率有较大的提高。

新型的细胞冻存技术包括：

玻璃化技术 ：玻璃化技术是一种新的细胞冻存技术，该技术可以将细胞冻存在玻璃态，而不形成冰晶。玻璃化技术可以提高细胞的复苏率，并降低细胞冻存液的毒性。

纳米技术 ：纳米技术是一种新的技术，该技术可以将纳米颗粒添加到细胞冻存液中，以保护细胞免受冰晶的损伤。纳米技术可以提高细胞的复苏率，并降低细胞冻存液的毒性。

7.2 细胞冻存液在生物医学研究和应用中的前景

细胞冻存液在生物医学研究和应用中具有广阔的前景。细胞冻存液可以用于：

* 保存濒危物种的细胞。

* 保存重要细胞株。

* 保存罕见或难以获得的细胞。

* 保存生物医学研究中的重要细胞。

* 保存人类和动物的细胞，以备移植之用。

* 保存细胞库，以备临床和研究之用。

结论

细胞冻存液在细胞生物学和生物医学研究中具有重要意义。细胞冻存液可以保存活细胞，并保持细胞的活力。细胞冻存液在生物医学研究和应用中具有广阔的前景。

参考资料

Cell Freezing and Thawing

https://www.bio-rad.com/zh-cn/applications-technologies/cell-freezing-and-thawing

How to Freeze Cells

https://www.thermofisher.com/in/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/cell-culture-protocols/cell-freezing-and-thawing/how-to-freeze-cells.html

Cryopreservation of Cells: Methods and Protocols

https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-0716-0550-8

Cell Freezing Media: A Review

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4687420/

Development of a Novel Cryopreservation Medium for Human Pluripotent Stem Cells

https://www.nature.com/articles/srep45660

The Use of Cryopreservation for the Maintenance and Distribution of Cell Lines

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3908799/

Cryopreservation of Primary Cells

https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/cell-culture-protocols/cell-freezing-and-thawing/cryopreservation-of-primary-cells.html

Cryopreservation of Stem Cells

https://www.stemcell.com/technical-resources/faqs/cryopreservation-stem-cells.html

Cryopreservation of Animal Cells

https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cryopreservation-of-animal-cells.html

Cryopreservation of Plant Cells

https://www.plantcelltechnology.com/article/cryopreservation-of-plant-cells/

撰稿人 | 生物库

责任编辑 | 邵丽竹

审核人 | 何发