清洁验证中活性物质残留限度标准探讨

叶笑、王立杰、颜若曦 2023-09-10

清洁验证是降低药品生产过程中污染和交叉污染风险的重要措施，活性物质残留限度是清洁验证中的重要标准，是评判清洁方法是否有效的关键指标。在制药行业发展过程中，针对清洁验证中活性物质残留限度出现了多种不同的计算方法和标准，各有不同的适用范围和优缺点。本文对不同活性物质残留限度的计算方法进行介绍，并对不同限度标准在选择及应用时需考虑的因素进行讨论。

清洁验证是降低药品生产过程中污染和交叉污染风险的重要措施，通过对清洁后设备进行取样、检查、检测、分析等证实清洁方法的效果，进而确保能够以可重现的方式对设备进行有效清洁，最终保障用药患者的安全。活性物质残留限度是清洁验证可接受标准的重要组成部分，是评判清洁方法是否有效的关键指标。在制药行业发展的不同时期，针对各类不同情形，提出过多种不同的活性物质残留限度计算方法和标准^［1］。本文对不同活性物质残留限度的计算方法进行介绍，对其优缺点进行分析，并对不同限度标准在选择及应用时需考虑的因素进行讨论。

Part

活性物质残留限度标准介绍

1.1

目视检查

目视检查指由操作人员通过目视观察清洁对象，确认清洁效果，通常以目视无异物为限度标准。目视检查不能够对残留物情况作出准确的定量判定，但也并不是完全不可预估，根据文献报道，目视检查能够观测到的残留物通常在1～4 μg·cm^－2范围内。

虽然目视检查仅为定性标准，但目视仍是清洁效果检查的重要标准。因为目视检查应用极为方便，相较于其方法需要取样、样品处理和检测等复杂过程，目视检查不需任何处理过程，即可直接、快速的完成观察。同时目视检查既可以对设备表面进行覆盖全部范围的检查，也能够根据对设备结构的认识对不易清洁的死角进行重点、反复检查。

目视检查的不足之处显而易见，由于目视检查标准依据的是观察者的主观判断，所以结果很容易受到观察者的主观影响，观察人员的态度、细致程度、对判断标准的把握等都会直接影响结果判定。同时该方法存在固有不足，不能对残留物质进行定量判断，也没有办法区分观测到的残留物具体是活性物质还是辅料，或其他物质。

1.2

总有机碳(Total Organic Carbon，TOC) 标准

总有机碳(TOC) 是以碳的含量表示水中有机物的总量，其结果以碳的质量浓度(mg · L^－1) 表示。碳是一切有机物的共同成分，是组成有机物的主要元素，水的TOC 值可以反应水中有机物的含量。因此，可以通过检测清洗后设备淋洗水的TOC 来评价设备的清洁状况。

使用总有机碳(TOC) 作为残留物限度，其优点包括检验方法简单，通常不需要开发专用的残留物检测方法; 适用范围广，不仅适用于对单一成分活性物质残留量的评价，也适用于残留物为多种物质的混合物或不能准确确定残留物具体成分的情况^［2］。

因为TOC 检测是非专属性的检测方法，其结果反应的是样品中全部有机物的含量水平，而检测样品中可能含有目标检测物质外的其他有机物，因此使用TOC 作为残留物限度标准时，其结果通常无法准确对应到某种具体残留物的量。同时TOC 是以碳的含量表示有机物的总量，由于不同有机物分子中碳的占比不同，因此对于不同残留物来说，相同的TOC 也可能代表不同的残留物水平。因此，多数时候TOC 只能反应清洁后残留物的总体情况，难以有效确认残留物的具体种类和准确残留量。

1.3

残留物浓度标准

残留物浓度标准是指设定残留物在后续生产药品中的浓度作为清洁验证限度标准，经常采用的浓度标准为10 ppm，因为通常认为当产品中残留物浓度低于10 ppm 时，即便未考虑残留物的具体特性，其能够产生的危害影响也是可以接受的。10 ppm 指前一生产产品( A) 残留的活性物质重量不得超过下一产品(B) 批量(按重量计) 的十万分之一(10 ppm) ，即B产品中含有的A 产品活性物质不超过其重量的十万分之一(10 ppm) ^［3］。

使用10 ppm 作为残留限度标准的优点是计算过程非常简单、应用方便，具体计算中仅需要知道后续产品的生产批量(按重量计) 即可计算出前一产品清洁后允许的活性物质残留总量。

残留物浓度标准(10 ppm) 在标准计算过程完全忽略了不同药品特性的影响，只要后续生产产品批量相同时，不管残留物是高活性、高毒性产品，或是一般产品，按照此方法计算得到的残留物限度都是相同的，未能体现基于风险进行控制的原则。同时，限度计算公式中仅考虑了残留物在后续产品中的总体浓度，未考虑因后续产品服用剂量不同，可能造成患者在单位时间内实际摄入的残留物数量存在很大差异，以及因此导致的不同风险影响。

1.4

基于药物活性数据的限度标准

基于药物活性的残留限度标准主要为药物最低治疗剂量的千分之一，通常认为当药物的摄入量低于其最低治疗剂量的千分之一时不会给患者带来不利影响。由此设定某药物(A) 的清洁残留限度为: 患者按照日最大治疗剂量服用清洁后生产药物(B) 时，由于清洁残留原因导致的A 药物摄入量不超过其最低治疗剂量的千分之一^［4-6］。

基于药物活性的残留限度标准以药物的生物活性为基础，计算得到的限度一定程度上反映了药品的特性。对于常规上市品种或已有充分毒理研究数据证明不属于高毒产品的品种，药理作用通常是药物对患者最主要的影响，最低治疗剂量的千分之一标准基本可保证患者免受非期望的药理作用影响。

不足之处在于治疗剂量虽然部分代表了药物的活性，但药物的治疗剂量和药物对人体产生影响的剂量间是存在差异的，同时治疗剂量的千分之一标准仅考虑了药效的作用，而没有考虑药物毒性对患者的影响。

1.5

基于药物毒理数据的限度标准

控制清洁后残留物数量的根本目的在于降低对患者造成危害的潜在风险，而残留物的毒理学特性与患者的安全风险直接相关，因此，近年来行业内越来越强调建立基于毒理学数据的清洁限度标准，通常称为基于健康的暴露限度。欧洲药品管理局(EMA)2014 年发布《Guideline on Setting Health-Based Exposure Limits for Use in Ｒisk Identification in the Manufacture of Different Medicinal Products in Shared Facilities》^［7-8］，世界卫生组织(WHO) 2021 年发布《Points to consider when including Health-Based Exposure Limits(HBELs) in cleaning validation》^［9］，都要求在确定清洁验证活性物质残留限度时应当考虑基于健康的暴露限度。我国《药品生产质量管理规范(2010 年修订) 》的附录《确认与验证》也规定: “活性物质残留限度标准应当基于毒理试验数据或毒理学文献资料的评估建立”^［10］。

基于药物毒理数据的残留限度包括依据急性毒性研究数据计算的标准和依据长期毒性研究数据计算的标准，在不同组织/不同时期采用过每日允许摄入量(Acceptable Daily Intake，ADI) 、日允许暴露剂量(Permitted Daily Exposure，PDE) 等不同表述。

1.5.1基于药物急性毒性研究数据

作为清洁验证残留限度计算依据的急性毒性研究数据主要为半数致死量(LD50) ，该数据是通过急性毒性试验中观测统计得到。

依据LD50 计算清洁验证残留限度时，通常首先通过给LD50 增加人体平均体重和安全参数折算得到无可见影响剂量(no observed effect level，NOEL) ，再根据药物给药途径设定不同的安全因子得到ADI，最终考虑后续生产产品批量及公共设备表面积后得到可接受的清洁残留限度^{［11， 12］}。通常NOEL及ADI的计算公式如下:

NOEL = LD50 × BD/2000 = LD50 × 70 /2000 (BD:成人平均体重，取70 kg; 2000: 安全参数)

ADI = NOEL /SF (SF: 安全因子，基于产品风险评估选择，一般体外给药10 ～ 100，口服给药100 ～ 1000，注射给药1000 ～10000) 。

1.5.2 基于药物长期毒性研究数据

用于清洁验证可接受限度计算的长期毒性研究数据主要为无明显毒性作用剂量(no observed adverse effect level，NOAEL)和最低作用剂量(lowest observed adverse effectlevel，LOAEL) ，在长期毒性试验中通过观察敏感动物、敏感器官的关键影响因素获得。

获得NOAEL 或LOAEL 数据后，需进一步考虑试验动物与人的种间差异、不同人体间的个体差异、残留物的毒性程度、毒性试验周期等因素，增加安全因子后计算得到PDE，最终考虑后续生产产品批量及公共设备表面积后得到可接受的清洁残留限度。通常PDE 的计算公式如下:

PDE = NOAEL /F1 /F2 /F3 /F4 /F5

F1: 物种差异系数(2-12) ，根据研究实验所采用动物的类型确定，其中大鼠为5，小鼠为12，狗为2，兔为2.5，猴为3，其他动物为10。

F2: 个体差异系数，固定为10。

F3: 时间系数，根据毒性研究实验持续的时间确定，持续半个生命周期( 啮齿类动物和兔1年，猫、狗和猴7年研究) 为1; 覆盖整个器官形成阶段研究的为1;啮齿类动物6个月或非啮齿类动物3.5 年的为2; 啮齿类动物3个月或非啮齿类动物2 年的为5; 短期的为10。

F4: 严重毒性系数(1-10) ，与母体毒性相关的胎儿毒性研究时为1; 与母体毒性无关的胎儿毒性研究时为5; 具有母体毒性的致畸作用的研究时为5; 无母体毒性的致畸作用的研究时为10。

F5: LOEL 系数，当无法获得NOAEL而采用LOEL 时，为10。

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残留限度标准的选择及应用

2.1

各类限度标准的基本应用

2. 1. 1 目视检查

目视检查通常不能作为清洁验证中的单一可接受标准使用，但其仍是清洁验证中的重要标准，因为目视检查可以有效补充其他标准的不足，能够发现其他取样检测中无法发现的污染物，另外对于带有颜色的残留物，目视也可以高效的发现清洁后未彻底去除的残留物。目视检查因其操作简便、迅速快捷，也经常被作为日常清洁检查的首选方法。使用目视检查作为清洁验证或日常清洁效果检查标准时，为提高观察结果的准确性、降低观察者主观性的影响，应当尽可能细化目视观察的操作方法，明确环境照度及观察者视力等要求，并对观察者进行培训。

2. 1. 2 总有机碳(Total Organic Carbon，TOC) 标准

对于残留物为多种物质的混合物或无法准确确定残留物具体成分，无法建立专属性检测方式，同时相关残留物质的安全风险较低时，可以考虑采用TOC作为清洁残留的限度。

为保证TOC 限度的适用性，应首先确认残留物质为有机物且包含可以在TOC 的测试条件下被氧化的碳。同时应当特别注意取样方法，一方面为保证样品具有代表性，应当确保淋洗范围覆盖计划的全部取样表面，淋洗时间和方式能够确保残留的活性物质能够转移至取样水中^［13］，另一方面因为环境中的有机物很容易进入样品进而影响样品的TOC 检测结果，所以也要特别注意取样、样品转运等过程中对样品的保护。

2. 1. 3 残留物浓度标准

残留物浓度标准(10ppm) 提供了一种简便的限度计算方式，对于常规品种，计算出的限度基本可以保证残留物污染处于较低的水平。但由于采用此种方式计算出的限度标准缺乏与残留物影响(活性、毒性) 间的关联关系，对于高风险产品，存在限度过宽的风险。

2. 1. 4 基于药物活性数据的限度标准

相较于残留物浓度标准(10 ppm) 标准，治疗剂量千分之一标准考虑了药物的生物活性特征以及患者可能的最大摄入量情况，体现了基于风险进行控制的原则，但对于特殊性质药物残留的控制仍显不足。

在使用最低治疗剂量千分之一方法计算残留限度时需要特别注意的是最低治疗剂量指的是该种活性物质所有治疗用途中的最低治疗剂量，而不一定是企业实际生产规格的最低治疗剂量。例如阿司匹林用于解热镇痛时最低治疗剂量约为300 mg，用于心血管疾病的一级预防时最低治疗剂量约为75 mg，某企业实际生产0. 5g 规格的阿司匹林片，但进行残留限度计算时应当以75 mg 作为阿司匹林的最小治疗剂量进行计算。

2. 1. 5 基于药物毒理数据的限度标准

目前EMA已不再认为依据LD50 计算得到的限度标准是基于健康的暴露限度，因为短期大量摄入化学物质造成受试动物死亡的半数致死量与长期摄入条件下造成影响的NOEL 间并不能仅凭固定的安全因子建立关联，长期摄入远低于致死水平的残留物也可能产生不期望的影响。

依据长期毒性数据进行残留计算是目前主要推荐的方式，因为其依据残留物质长期摄入可能对患者造成伤害的风险来制定。但此种限度计算方法也是数据要求最高、计算最为复杂的方法，因为NOEAL的获得需要综合考虑药物的关键影响、敏感动物、敏感器官、毒性程度等，通常必须要有专业的毒理学专家参与才能制定。同时，在各毒理数据库中查询得到的数据也不尽相同，存在同种物质在不同机构试验中得到的毒理数值出现数量级差异的情况。另外，对于低毒性、低活性产品，使用PDE 计算得出的限度标准可能过宽，甚至会高于目视无异物的标准，从而也存在不适用的情况^［14］。

2.2

残留限度标准应用的考虑

2. 2. 1 基于风险

不同残留物的性质各异，对患者造成危害的严重程度差异巨大，因此制定残留物限度时也并不宜采用完全统一的标准。对于低风险产品，如不含有毒性或禁忌药材的中药产品，强求严苛的定量限度标准可能造成无效的资源消耗; 反之对于高风险产品，如高毒高活产品，不够科学的限度可能增大交叉污染的可能，进而给患者造成严重危害。因此，在确定活性物质残留限度时，应当综合考虑药物的性质和用途等，充分评估可能给患者造成的风险，并以科学数据为基础。

2. 2. 2 综合互补

不同限度标准也存在互相补充的可能，如目视检查虽不能作为清洁验证中的唯一标准使用，但却可以补充其他标准的不足，能够发现化学检测残留取样检测中无法发现的污染物，另外对于中药等带有颜色的产品，目视也可以有效的发现清洁后未彻底去除的残留物。对于成分不明或多组分的残留物，在定量检测代表性成分的同时，补充检测TOC 也为评估整体残留水平提供了一种参考。结合具体情况，综合利用不同限度，可以使得到的限度标准更加适用。

2. 2. 3 限度最低原则

对于可同时采用传统方法(10 ppm、最低治疗剂量千分之一) 和基于毒理研究数据计算得到残留物定量限度的情况，为最大限度保障用药患者安全，行业实践中通常将多个公式计算得到的结果进行比较，选取最为严格的限度作为最终标准。

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残留限度标准检查常见问题

在药品检查中，活性物质残留限度标准是清洁验证最容易出现问题的方面^［15］，常见问题包括残留限度标准制定不合理、具体标准限度数值制定依据不充分、清洁验证中未按验证方案规定项目进行全项检测等。缺陷参考实例如下:

3.1

残留限度标准制定不合理

实例1: 某企业2区激素类生产线与非激素类产品共用生产设备生产，其清洁验证中选择的活性成分残留目标物为利巴韦林，未对共线生产激素与非激素产品的安全性、可行性进行充分评估，未选择激素类作为残留检测目标物。

实例2: 某企业清洁验证中残留检测标准只有目视检查。

实例3: 在清洁验证标准制定中，企业对制粒、总混、压片、包衣工序相关设备的共线品种风险评估未考虑其他品种(特别是缬沙坦) 对左氧氟沙星片生产的影响。

实例4: 某企业一原料药有两种生产工艺，一种为国内药品注册生产工艺，一种为出口产品生产工艺，两种工艺起始物料和合成路线不同，均在同一(合成+精制) 车间共线生产，清洁验证中未评估改换生产工艺时可能带来的溶剂残留和杂质影响。

3.2

具体标准限度数值制定依据不充分

实例1: 某企业验证方案中活性物质残留量采用计算公式为L = (10 × 10 － 6 × B) /(S × F) ，公式中B应为下批产品的最小批量，实际计算选择了下批产品中活性物质残留成份总重量。

实例2: 某企业对最终淋洗水的残留限度标准设定为注射用水的药典标准，未与即时生产的该用水点的注射用水检测数据进行比对，未结合活性物质情况分析该限度标准的合理性(如10 ppm 和TOC 值的关联性) 。

实例3: 清洁验证限度10ppm 的确定没有足够的评估和计算来支持，未考虑毒理学、药物活性等因素。

3.3

清洁验证中未按验证方案规定项目进行全项检测

实例1: 某企业清洁验证方案中要求分别采用擦拭取样和淋洗水取样检测设备活性残留，实际仅对淋洗水取样样品进行残留检测。

实例2: 某企业生产设备清洁验证未严格按照方案执行，清洁验证的可接受标准包括: 目测、澄清度、薄层检验及TOC 检测，验证报告缺少薄层检验项目。

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结语

确定科学合理的活性物质残留限度是清洁验证中的关键工作，是准确评价清洁方法效果的基础，同时也是一项复杂的工作。如本文所述，确定活性物质限度标准时不存在简单统一的标准^［16］，只有充分研究认识产品及残留物质，合理利用科学知识，切实秉持以患者安全为中心的理念，基于风险并充分考虑对患者健康的影响，才能制定出适合具体情况的、合理的限度标准。

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