两个人完成同样的实时PCR(real-time PCR)实验有可能得到不同的结果。研究人员正在量化这一差异性以了解它的来源以及如何解决这一问题。

当一个细胞中某个基因的表达增高时，首先衡量的可以是基因与它的最终蛋白质产物的中间分子——信使RNA(mRNA)。对于希望基于健康、环境或内部线索对细胞进行追踪的科学家们而言，测量mRNA分子的改变是一种追踪细胞基因上调、下调、开启或关闭的最好的途径。

自从 20世纪90年代中期以来，逆转录定量PCR(RT-qPCR)即成为了追踪单细胞中mRNA分子浓度的常用方法。然而RT-qPCR的每一步都可能将错误引入到实验中。现在，一些科学家们正试图退后一步观察如何能够通过优化将RT-qPCR应用于研究领域，来改善他们的研究数据。

葡萄牙米尼奥大学微生物学家Nuno Cerca 说。“当前有大量的研究工作针对标准化qPCR方法。然而我认为它仍被低估了。尽管遵循标准化指南，我们可以获得重现性好的研究结果，但它们并不可靠。”

Cerca 提到的现有指南是指MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments)， 简称mykee，是一套在国际上最新推出的指导方针，就评价qPCR实验和发表文章时所必需的实验信息提出了最低限度的标准。这些指南首次由伦敦大学玛丽皇后学院的分子生物学家Stephen Bustin领导的研究小组于2009年发布在《临床化学》杂志(journal Clinical Chemistry)上。该指南提出了研究人员应该纳入到他们的qPCR实验中的一些细节以确保获得准确的结果。它们被分为四个关键领域：样本质量控制、实验设计、PCR效率和标准化。

“在同行评审的文献中MIQE指南现已被引用超过600次，成为了《临床化学》发表的论文中引用排名第八的文章。因此这一信息已经开始传播至整个研究群体，”Bustin说。

然而有一些研究人员却并没有审核MIQE推荐的优化步骤继续开展qPCR实验，并公布他们的研究结果。“我认为这些人并不是不知道这一指南，只不过为了所谓的方便不想遵循它们而已，”加拿大国立科学研究所(INRS)Armand-Frappier 研究所的Cathy Vaillancourt说。

回归基础

在加拿大国立科学研究所的实验室中，Vaillancourt研究了健康孕妇与患有妊娠糖尿病或先兆子痫孕妇的胎盘差异。为了了解这些疾病，Vaillancourt和她的同事们观察了在不同胎盘中基因表达水平的差异。她们依赖RT-qPCR来定量指定目的基因生成的mRNA量。

去年，Vaillancourt开始利用新型的Bio-Rad实时PCR仪开展一系列的RT-qPCR 实验。然而当她的两个学生从事相同的实验时，他们得到了不同的实验结果。因此，她开始去了解是什么将差异引入了RT-qPCR实验中以及研究人员如何能解决这一问题。她很快确定参考基因是她的研究团队差异性的主要来源。

由于不同的样本有可能开始有着不同浓度的总 RNA，为了控制它研究人员必须依靠参考基因——这些基因被认为在所有细胞中以相同水平表达。如果基于RT-qPCR实验，在某个组织中一个参考基因水平要高两倍，那么就意味着研究人员必须将目的基因的浓度减半以确保真实比较相对值。

两个人完成同样的实时PCR(real-time PCR)实验有可能得到不同的结果。研究人员正在量化这一差异性以了解它的来源以及如何解决这一问题。

Vaillancourt 说：“胎盘有大量的RNA降解酶，在样本被分离出来以前许多的mRNA有可能被降解。”事实是像糖尿病和先兆子痫这类可以引起广泛遗传改变的疾病，甚至也有可能改变了参考基因的水平，这使得Vaillancourt开始猜想她们选择的参考基因将大量的错误引入到了研究小组RT-qPCR实验中。

Vaillancourt 回归到基础，她并没有理所当然地将常用的参考基因作为她研究工作的最佳选择，而是利用两个计算机程序分析了参考基因的稳定性，计算出最稳定的，能够在健康和疾病胎盘样本中维持最一致水平的参考基因。这是MIQE推荐的一个步骤，但是Vaillancort之前并没有人这样做。

她的研究发现远远超出了她预期的结果。当她将选择的一个参考基因与另一个比较时，样本间基因水平差异如此之大，可完全逆转单个目的基因中观察到的趋势。

“用一个参考基因会使目的基因看起来表达增高，而用另一个参考基因则使其看起来表达降低，”她说。

她的研究团队得到的教训是在qPCR实验中参考基因的选择非常重要。Vaillancourt 说：“现在，我们每次做实验时都要做到这一点。我们会一直尝试为特异实验寻找最好的参考基因——这些基因在我们研究的组织间具有最小的差异。”

试剂盒vs.试剂盒

在葡萄牙米尼奥大学Cerca的实验室中，问题并不在于参考基因，而是选择最适合研究的RNA抽提试剂盒。Cerca研究的是附着在固体表面生长的细菌形成的生物膜。Cerca发现从大肠杆菌中抽提出RNA相对容易，然而当他试图从其他类型生物体的生物膜中抽提出RNA时，开始出现了问题。一些RNA抽提试剂盒似乎无法良好地发挥作用。

Cerca 说：“曾经有一些文献描述不同的RNA试剂盒会生成不同质量的RNA。然而，不同质量的RNA并不一定意味着我们会获得不同的基因表达结果。最终，且最重要的问题是：什么试剂盒可以让我们以尽可能最低的价格获得可靠且有意义的结果?”

Cerca 研究小组着手比较了五个商业化RNA抽提试剂盒用于三种不同的食物传播形成生物膜的细菌。他们在每个试剂盒中采用的是完全相同的样本，运行RT-qPCR 试验来量化来自每个抽提试剂盒的RNA。尽管利用试剂盒获得RNA产量和纯度没有对RT-qPCR试验产生影响，然而RNA的完整性(即RNA降解程度)却影响了实验结果，在不同试剂盒间存在差异。

“我不得不承认我对我们获得的一些结果感到惊讶：在某些情况下，RNA浓度降低3倍，却存在超过10倍的差异基因表达，”Cerca说。

他的研究小组找到了最好的试剂盒，这一试剂盒最适合于生物膜研究。但它并不一定对每个人都是最佳的。通过比较实践是关键。对于每个研究人员而言，鉴别他们的qPCR实验哪些方面需要优化非常重要。

MIQE 指南的倡导者Bustin现在正致力推动对希望学习实时PCR或希望改善实验结果的研究人员给予更全面的培训。他已经开发了一系列的iBooks，让科学家们通过几个步骤来优化qPCR实验。

“一个精心设计的实验与另一个针对同一目标的精心设计的实验不会有太大的差异。但是两个粗陋设计的实验就会生成不同的结果，”Bustin说。