除菌过滤是一种通过物理截留方法去除液体或气体中微生物的过程，要求在工艺条件下每平方厘米有效过滤面积能够截留 107 cfu 的缺陷型假单胞菌[1]，以确保药品的无菌性。《2023年版 GMP 指南-无菌制剂(上册)》[2]和 PDA TR26[3]《Sterilizing Filtration of Liquids》为除菌过滤工艺的验证提供了详尽的指导和要求。验证过程包括过滤器的选择、细菌截留能力的测试、完整性测试以及与待过滤介质的相容性评估等。此外，报告还强调了过滤器的灭菌方法、使用后的完整性测试以及可能的重复使用问题。通过遵循 GMP 和 PDA TR26 的指导原则，制药企业可以有效地实施和验证除菌过滤工艺，但在实际应用中，除菌过滤工艺的验证是一个复杂的过程，涉及多个方面的考虑，且除菌过滤工艺的验证是药品检查的重点内容，越来越受到更多的关注[4]。本文将详细探讨除菌过滤工艺验证的主要项目，包括验证方法的选择、验证过程中的关键控制点等。

Part1 化学兼容性试验

化学兼容性试验是指评估除菌过滤滤芯在特定工艺条件下与待过滤介质是否会发生不良的化学反应或相互作用的测试。国内外 GMP 相关条款对直接接触药品的材质有约束，例如我国 GMP[5]要求与药品直接接触的生产设备表面应当平整、光洁、易清洗或消毒、耐腐蚀，不得与药品发生化学反应、吸附药品或向药品中释放物质，因而在滤芯选型时就应考虑滤芯与工艺流体的化学兼容性，以确认工艺过程不会改变滤芯执行其特定功能的效能。

1.1化学兼容性试验的方法

化学兼容性试验的方法通常有静态浸泡和动态循环过滤两种方法。静态浸泡是指按照最差工况条件把过滤器或滤膜浸泡在工艺流体中，并测试浸泡前后过滤器或滤膜的物理参数。动态循环过滤是指按照最差工况条件，过滤器与装有工艺流体的容器及管路相连，通过蠕动泵使管路里的料液循环过滤，达到模拟工艺过程的目的，最后测试过滤前后过滤器的物理参数。

1.2化学兼容性试验的测试项目

上述试验方法的试验对象如仅使用滤膜，无法反映过滤工艺条件对过滤器上下游支撑层、内外龙骨、上下端盖等组件的影响，因而试验对象应包括整个过滤器。过滤工艺条件对过滤器的影响可以通过过滤器的整体完整性(包括滤膜、滤壳、O型圈等)、溶出物、张力强度、流速、压差、滤出液品质、过滤器外观检测或扫描电镜检测、爆破压力等参数的变化进行评估[6]。在通常情况下，我们对化学兼容性试验中的测试内容包括过滤或浸泡前后的完整性测试、过滤器的物理结构(长度、直径、重量等)，另一方面，滤膜的外观、厚度、滤膜的结构和孔径、拉伸强度也是关注的测试项目，其中滤膜的结构和孔径可以通过电镜图获得。

1.3化学兼容性试验的可接受标准

过滤器、滤膜必须通过试验过程中的所有完整性测试，同时外观检查方面要求无变形、无脱落物、无变色。其余物理参数如直径、重量、厚度，目前 ISO13408-2:2011[7]关于药物的无菌生产中第二章节过滤和 PDA Technical Report 26 液体除菌过滤(2008)中的相关章节无给出具体的标准，一般要求相对偏差±2 %至±5 %之间。

Part2 细菌截留试验

尽管药品生产采用的除菌过滤滤膜的孔径通常为 0.22 m，但直接测量孔径并不能充分代表滤芯的截留能力。这主要有三方面的原因：(1)过滤机理复杂：滤芯的过滤机理包括拦截、吸附、扩散等，不仅仅依赖于孔径大小；(2)孔径分布：滤芯的孔径通常不均匀，存在较大的孔径，且孔径 0.22 μm 并非指过滤器的平均孔径[8]，因此需要通过细菌截留试验来验证其实际的截留效果；(3)产品和工艺条件的影响：药液的性质和工艺条件可能影响滤芯的截留性能，如 pH 值、离子强度、表面活性剂等。因而需要用细菌截留试验来验证滤芯在模拟实际工艺条件下对微生物的截留能力，确保过滤后的液体达到无菌要求，而不依赖于孔径的测量。

2.1细菌截留试验的方法

目前细菌截留试验的方法主要参考 ASTM F838-20[9]中的标 准 测 试 方 法 ， 该 方法 由美 国 材 料 与 试 验 协 会 (ASTM International)发布，用于评估除菌过滤器的细菌截留能力。依据这一流程，测试阶段大致可分为三大步骤来进行。(1)过滤器在灭菌后，使用缺陷型假单胞菌(ATCC19146)悬浮液进行挑战，悬浮液浓度为每平方厘米有效过滤面积含有 107 个细菌。(2)测试在最大压差 30 psi 并保证每平方厘米有效过滤面积的流速为 2 L/min~4×10-3 L/min 的条件下进行。(3)整个滤液过滤后下游使用 0.45μm 的膜片作为分析膜过滤器来收集可能未被测试过滤器截留的缺陷短壁单胞菌，然后把该分析滤膜放置于培养基上培养。未被测试滤器截留的微生物将在分析膜上形成可见菌落，然后进行计数。

2.2阳性对照测试

为了防止因微生物体积稍大而引发的实验结果出现假阴性，需要确保所使用的挑战微生物能够通过 0.45μm 孔径的膜，以此作为阳性对照的标准。在标准培养基中培养的缺陷短波单胞菌，在高浓度挑战条件下(通常每平方厘米≥10个菌落形成单位)，会有少量能够穿透 0.45 μm 滤膜。采用与测试过滤器平行测试的方式，收集挑战细菌悬液对 0.45 μm滤膜进行过滤测试，下游滤液再用 0.45 μm 或 0.22 μm 滤膜截留过滤，如挑战的细菌是足够小的，则可以穿透 0.45 μm 滤膜，并被下游滤膜截留。

2.3细菌存活性测试

在开展除菌过滤的细菌截留能力验证之前，首先要实施细菌存活性检验，这一步是为了评估挑战菌在所使用工艺流体中的生存能力，从而确定工艺流体是否具有抑制细菌生长的特性。如工艺流体对挑战菌无抑菌性，则可以将挑战菌置于工艺流体中制备成细菌截留试验中使用的菌悬液。如测试表面工艺流体对挑战菌有抑菌性，则于测试过滤器使用工艺流体完成了工况模拟后，选取无抑菌性的替代溶液(如 0.9 %生理盐水)继续下一步的挑战试验。细菌存活性测试中通常选取无菌 0.9 %生理盐水作为对照。把一定浓度(如＞108 个/mL)的缺陷型假单胞菌加入工艺流体以及对照溶液中，测试工艺时间内，微生物数的变化。若工艺流体中微生物菌落数比对照溶液中存活的微生物菌落数减少不超过 1 个 log，则表面工艺流体对挑战菌没有菌性；反之，则有抑菌性。

2.4试验装置的灭菌

为排除试验装置对试验结果的影响，细菌挑战试验前需要对整个试验装置进行湿热灭菌，确认无菌。一般保持蒸汽温度121 ℃下 30 分钟，也使用其他时间和温度组合进行灭菌，只要能够证明达到或高于 10-6 的无菌保证水平(SAL)[10]。

2.5过滤器的选择

由于过滤器的微生物截留量与非破坏性起泡点测试的相关性[11]，即当起泡点越高，LRV(log reduction value，微生物截留值的对数)越高，因而在细菌截留试验中，应选择起泡点较低的滤芯批次进行挑战试验。在进行细菌截留能力的验证研究时，通常涉及三个不同批次的过滤膜，其中至少有一个批次的物理完整性测试结果虽然合格，但数值接近(在 10 %以内)制造商规定的最低可接受标准。若在验证中没有使用低泡点滤膜，那么在实际生产中所使用的滤器泡点值，必须高于验证试验中实际使用的滤膜最小泡点值。另一方面，由于扩散流测试与过滤器的微生物截留量同样存在着相关性，因而选择扩散流作为完整性测试方法时，也可以考虑选择扩散流测试结果为边缘值的滤芯批次作为细菌截留试验的对象，如三支过滤器中至少一支的扩散流值应为边缘数值。

2.6细菌截留试验的可接受标准

细菌截留试验的可接受标准应至少包括 4 点要求：(1)分析膜过滤器上没有缺陷型假单胞菌的菌落；(2)阳性对照测试的分析膜过滤器上有缺陷型假单胞菌的菌落；(3)整个试验装置无菌；(4)挑战用的细菌悬浮液中缺陷型假单胞菌的数量达到了规定的标准，即每平方厘米的有效过滤面积上至少含有1×107个菌落；过滤器必须通过挑战前和挑战后的完整性测试，所测得的完整性检测数据应当在待测过滤器允许的范围内。

Part6 可提取物及浸出物试验

为确保工艺流体与过滤器的直接接触过程不会导致过滤器向工艺流体释放物质且两接触表面不发生化学反应、不会产生新的物质，除菌过滤工艺需要进行可提取物及浸出物试验。“可提取物”是指在特定的溶剂中，在比生产工艺条件更为极端的时间和温度下，从任何与产品接触的材料成分中溶解出来的物质。这些可提取物反映了在最不利情况下，可能迁移到产品中的物质的最大量。[12]而“浸出物”则是指在实际的生产过程中，从与产品接触的材料中迁移到产品中的化学物质。这些浸出物是最终药品中存在的物质，通常它们是可提取物的一部分[12]。

从滤芯制造商向制药客户提供的滤芯产品资料(如验证指南、产品使用指南)，可知滤芯制造商一般会进行相关滤芯在纯水或某种有机溶剂上的可提取物试验，但在实验室条件下的可提取物水平仅供参考，不同溶剂、不同浓度、不同温度、不同接触时间下的可提取物水平不具等同性，应结合实际工况及具体的工艺流体进行测试。

3.1可提取物及浸出物的试验方法

可提取物及浸出物试验是一种重要的安全性评估手段，用以评估除菌过滤滤芯中可能迁移至药品中的化合物。理想情况下，最好使用实际药液作为提取介质。但是，实际药液组分可能对分析过程形成干扰，而导致不能使用实际药品。在这种情况下，应使用最接近实际产品制剂的模型溶剂。在确定模型溶剂之前，需要对制药工艺中的流体配方进行详尽的评估。所选用的模型溶剂需要能够反映实际药物配方的特性，并且与过滤系统之间不存在化学兼容性的障碍。理想情况下，这些溶剂应具备与最终产品相同或相近的物理化学特征，例如 pH 值、极性以及离子强度等。一旦选定了合适的介质，可以通过静态浸泡或动态循环的方式来进行可提取物的测试。测试过程中需要考虑多种因素，包括灭菌技术、冲洗过程、过滤液体的化学属性、生产时间、操作温度、过滤量与过滤膜面积的比例等[13]。因而试验一般先用模型溶剂在最长过滤时间、最高过滤温度、最多次的灭菌次数下对滤芯进行潜在可提取物分析，最后用实际药液作为提取介质进行浸出物的定性分析。

3.2可提取物及浸出物的分析方法

在完成可提取物或浸出物的试验之后，我们需要对提取介质或实际药液中检测到的可提取物或浸出物的种类和含量进行分析。在进行药品中可提取物和浸出物的分析时，我们需要根据待检测药液的成分以及与温度和提取时间相关的工艺参数来选择合适的分析方法。由于可提取物和浸出物可能具有很大的浓度差异，并且组成可能相当复杂，因此，不可能存在一种适用于所有情况的分析方法。在选择分析技术时，我们必须确保它既适用又能够同时考虑到对可提取物和浸出物的检测灵敏度，以及来自药液成分的潜在干扰。

滤芯释放到提取介质中的可提取物和浸出物可能包括多种类型的化合物，如挥发性有机物、半挥发性有机物、热敏型有机物、抗氧化剂和不挥发性物质等。对于挥发性和半挥发性有机物，以及热敏性有机物和抗氧化剂，我们可以使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术进行测试。这些技术能够有效地分离和检测这些类型的化合物。而对于不挥发性物质，我们可以使用核磁共振(NMR)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术进行测试。这些技术对于检测那些不易挥发或在常规色谱条件下不易检测的化合物特别有用。总的来说，选择合适的分析方法需要综合考虑待测物的性质、检测的灵敏度要求以及可能的干扰因素，以确保分析结果的准确性和可靠性。

3.3可提取物及浸出物的毒理学评估

对可提取物或浸出物进行了定性和定量分析后，需要结合药品最终剂型中这些可提取物或浸出物的浓度、给药的剂量大小、给药的时间长度以及给药的方式等因素，依据 ICH Q3C[14]或 ICH M7[15]指南，应对实验数据进行彻底的安全性评价，以确保从材料中提取出的物质或在生产过程中释放的物质不会对人体健康构成潜在威胁。在这一评估阶段，建议详细描述这些提取物或浸出物的化学构成，以便进一步分析它们是否含有可能引起警觉的特定结构特征。

Part4 结语

除菌过滤工艺的验证不仅仅包括之前提到的化学相容性测试、细菌截留能力测试和可提取物及浸出物测试，还需要进行吸附性能测试以及使用产品作为润湿介质的完整性测试等。这些验证工作应根据具体的过滤介质和工艺条件来进行，以确保全面地验证除菌过滤工艺的有效性。另一方面，如果产品、过滤器或工艺参数中的任何一个因素发生了变化，都需要重新评估已验证的除菌过滤工艺的有效性。因而，在完成过滤工艺的初次验证之后，为了保证过滤过程的持续有效性和安全性，需要定期对产品的特性和工艺条件进行评估以确定是否需要进行再验证。

参考文献