各国药典[中国药典（ChP）、美国药典（USP）、欧洲药典（EP）]收载的多种释放装置通常适用于常规制剂（如口服和透皮制剂），目前ChP2020收载释放度检查的品种有50个，其中缓释制剂25个，肠溶制剂24个，贴剂1个，25个缓释制剂的给药间隔基本为1d。25个释放度检查方法中，有11个为篮法，12个为桨法，2个为小杯法。桨法、篮法已用于开发长效注射剂的药物释放方法，往复桶法（USPⅦ法）也可用于检查药物洗脱的释放研究。如美国FDA释放度数据库中用桨法检查阿立哌唑长效肌内注射剂体外释放，转速为50r·min^-1，0.25%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液900mL为溶出介质，取样时间为10、15、30、60、120、180、240、300、360、420和480h[6]；Nanaki等[7]用篮法研究了利培酮控释微球的体外释放，用适当的透析管纤维素膜将微球放入溶出篮中，溶出温度为（37±1）℃，转速为50r·min^-1，磷酸盐缓冲液900mL为溶出介质。美国FDA释放度数据库中用往复筒法检查地塞米松眼用植入剂体外释放，50目篮，0.05g·L^-1SDS的磷酸盐缓冲液30mL为溶出介质，取样时间为12、24、48、72、96、120、144、168、192、216和240h[6]。

表1总结了部分药典释放装置用于长效注射剂释放度检查的方法。其中，流通池法（ChP第六法）在评估长效肠外缓释剂型体外释放中应用最广泛。流通池法分为开环式和闭环式2种，开环式流通池可以保证大量新鲜的溶出介质不断接触被测样品，适用于一些大剂量、难溶性药物溶出度的测定；闭环式流通池对于载药量少并且难检测的样品可以用少量的介质进行试验，另外，介质瓶盖相对密封，介质蒸发较少，对于实验影响不大，这对于长效释放的样品有优势。流通池法的优点有：可提供连续的新鲜溶出介质，即使对于难溶性药物也能提供漏槽条件，更接近体内环境，克服了传统溶出度测定法方法缺乏漏槽条件所引起的偏差；能够通过释放介质的不同流动方式模拟真实体内的环境[7]；在测试过程中实验条件可以灵活变化，如实验介质的组成、pH值、流速等；样品可固定于流通杯中，适用的剂型广泛，如微球、脂质体、药物凝胶支架和植入剂等[8]。如：美国FDA释放度数据库中用流通池法检查注射用双羟萘酸奥氮平体外释放的方法，流速为3mL·min^-1，含1%SDS的pH6.8磷酸盐缓冲液为溶出介质，取样时间10、20、30、45、60、75、90、105、120、150、180、240、360、480、600和720h[6]。Tang等[9]和Liu等[10]建立了流通池法测定两性霉素B脂质体体外溶出，可以区分已上市两性霉素B脂质体原研产品（AmBisome）及其仿制药，对产品质量控制以及仿制药开发具有重要指导意义。

然而，上述药典方法也存在一些局限性，限制了其作为研究长效注射剂体内外相关性溶出方法的可接受性。这些限制主要包括：（1）篮法和桨法需要大体积的溶解介质，较低的介质体积会导致流体动力不稳定；（2）篮法和桨法不能自动改变介质pH值，溶出介质体积固定，对难溶性药物难达到漏槽条件，调整转速对区分不同品种的固体制剂影响不大；（3）常规药典方法在较长溶出实验中，释放介质会蒸发；（4）流通池法虽然具有较好的重现性和区分力，但设备昂贵且长期释放研究（如1~6个月）对设备具有挑战，且会存在由于聚合物迁移堵塞管路，导致流速不一致的现象。因此，研究人员针对长效注射剂的剂型特点也研发了多种非药典释放度检查方法。

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除药典方法外，监管机构也批准了多种非药典长效注射剂释放度检查方法，如取样分离法（包括摇床法、恒温水浴法等）、透析法、扩散池法，这些方法属于非标准化的检测方法，设备参数的调整可能会引入较大偏差。例如，摇床法使用不同性状和材质（吸附性能不同）的孵育容器、释放介质以及摇晃强度均会对药物释放产生影响，这些由试验方法引入的偏差甚至能够掩盖处方或工艺变化带来的体外释放行为的差异[21]。非药典释放度方法开发时应关注试验条件考察，包括装置振摇方式、释放容器差异、样品加入和取样方法等。应考察方法的适用性和耐用性，如实验室不同、试验装置略有差异、方法参数适当变化等多种情况对释放度检测的影响。在长效注射剂释药检查中，改良的非药典药物释放方法主要包括以下几种：

2.1 取样分离法

取样分离法是长效注射剂体外释药检查中应用最广泛的溶出方法，使用的介质体积不受限。通常，将待测物分散于一定体积恒温释放介质中，定时取样，取样后及时补充等量新鲜释放介质以维持相应漏槽条件，通过测定药物累积释放量评估药物释放行为。取出的样品可以使用过滤器分离介质和待测物，对于微球等制剂取样时需将释放介质离心，取样上清液测试。在某些情况下，可能需要更换释放介质以维持“漏槽”条件或避免释放介质中的药物降解，不同的实验装置（如容器大小、搅拌和取样方法）也会影响体外药物释放。应用取样分离原理最常见的方法有摇瓶法/摇床法、恒温振荡水浴法等。

取样分离法具体操作时通常是将装有制剂和溶出介质的容器置于恒温水浴（通常为37℃）或恒温培养箱内的摇床上（通常转速为50~75r·min^-1），所用容器的大小取决于溶解所需介质的量，很多研究者在研究中使用试管、锥形瓶甚至大烧瓶作为容器。美国FDA释放度数据库中用取样分离法检查醋酸戈舍瑞林缓释植入剂的体外释放度，样品和50mL pH7.4磷酸盐缓冲液介质一同置于120mL规格的Wheaton瓶中，39℃孵育（置于恒温箱或恒温水浴装置中），取样前将Wheaton瓶放在振荡器上振摇，摇动幅度为50mm，205r·min^-1转速振摇6s，取样时间为3、14、35、56、84d（10.8mg规格）和7、14、17、21、28d（3.6mg规格）[6]。Wang等[22]用取样分离法对盐酸米诺环素微球进行体外释放检测，将约4mg微球分散在10mLPBS（10mmol·L^-1，pH7.4，含0.02%Tween20）中，样品和介质置于螺旋盖管中，将螺旋盖管置于旋转器上，转速为100r·min^-1，37℃孵育（置于对流培养箱中），第1天取样4次，后面10d每天取样2次，剩下9d每天取样1次。Nahata等[23]采用摇瓶法研究了PLGA微球中奥氮平的释放，并进行了14d的研究。Wang等[24]改进了该方法，将样品放入茶包中，而不是直接放置在溶出介质中，将微球放入茶包后，用订书钉密封，放入装有50mL释放介质的罐子中，然后将罐子置于轨道激振器上，温度为37℃，转速为50r·min^-1。表2总结了部分取样分离法在长效注射剂体外释药研究中的应用。

使用取样分离法可以直接检测药物释放度，方法较简单，适用于任何体积的溶出介质。该方法可用于药物与介质直接接触而出现突释的制剂的检测，更换介质有助于保持漏槽状态。该方法的缺点包括：取样过程冗长且烦琐，在分析前需要对样品进行过滤或离心，这可能导致释放介质中样品颗粒的损失；由于搅拌不充分会形成颗粒物聚集，可能导致药物释放变慢；在药物释放研究中，容器的形状和大小变化可能导致实验室内部和实验室之间数据不一致。

2.2 透析法

透析法是使用具有一定截留相对分子质量的透析膜将释放出的药物进行物理分离后选择合适的时间间隔测定释放介质中药物浓度的一种方法。与取样分离法相比，透析法可以利用透析膜分离游离药物与长效注射剂，在释放过程中可避免反复取样导致的药物损失，以及取样后烦琐的游离药物分离操作。根据装置、容器大小和分子截留量的不同，透析法主要可分为正向动态透析法、反向动态透析法和结合透析法。透析法中影响药物释放速度的重要因素是透析膜材质和截留相对分子质量。透析膜材质主要有再生纤维素、纤维素酯和聚偏二氟乙烯[38]。需充分评估透析膜对药物的吸附作用，避免释放出的游离药物大量吸附于透析膜表面，进而影响游离药物向释放介质中扩散。此外，还需系统优化透析膜截留相对分子质量，需在满足游离药物扩散通过的同时，避免纳米药物中小粒径颗粒通过或堵塞透析膜。透析法虽然操作简单，但在实际应用中仍然存在一定问题。如待测药物在透析袋或透析装置中聚集或沉降，透析袋或透析装置形状不固定导致释药表面积存在差异，在溶出装置中位置无法固定，难溶性药物易吸附于透析膜中，透析袋内可容纳的介质体积有限、难以达到漏槽条件等。

2.2.1 正向动态透析法

正向动态透析法是借助截留一定相对分子质量的透析袋或透析管透析池，将待测物分散于少量的释放介质并密封在透析袋中，然后将透析袋置于装有一定量释放介质的容器中，使游离药物扩散至释放介质，按照一定的时间间隔取样，同时补充等量的空白释放介质，通过测定药物累积释放量来评估药物体外释放度。一般透析袋内释放介质的体积远远小于容器中释放介质的体积，如透析袋内释放介质的体积为1~10mL，而容器中的体积为40~90mL，因此，容器的大小取决于所需释放介质的总体积。

赵笛等[39]用正向动态透析法考察吸入用瑞德西韦脂质体体外释药行为，将待测溶液置于透析袋，透析袋截留相对分子质量为3500，以200mL模拟肺液作为溶出介质，37℃恒温，取样体积1mL，取样后立即补液，结果显示瑞德西韦脂质体在该释放介质中约4h即能够释放大于90%。林雯等[40]采用逆向蒸发法制备替莫唑胺脂质体，用正向动态透析法考察了替莫唑胺的体外释药行为。将待测物放至透析袋，透析袋两端用夹子固定，置于100mLpH5.0的磷酸盐缓冲溶液中，37℃恒温水浴振荡，速度100r·min^-1，定时取样并补液，研究结果显示该脂质体前2h属于突释阶段，释放量约60%，后进入缓释阶段，释药速度变缓，6h时基本释放完毕。

正向动态透析法操作简便，对设备要求较低，取样后无需再进行过滤操作分离脂质体和游离药物，但需考察药物与透析袋的相容性及透析袋对药物的吸附性，且透析袋内介质几乎不流动，会影响待测物释放速率。此外，搅拌速度不宜过快，否则透析袋转动过快或幅度过大，容易破损，导致药物泄露。

2.2.2 反向动态透析法

反向动态透析法是将长效注射剂与释放介质直接接触的一种释放方法，待测物与释放介质之间没有任何透析膜隔开，将待测药物使用大体积释放介质稀释置于容器，将含有空白释放介质的透析袋或透析装置置于上述容器，测定透析袋内释放介质中药物浓度。待测制剂的表面与释放介质直接接触，可以更好地模拟体内环境。反向动态透析法的优势在于可以使长效注射剂得到最大限度的稀释，并使得系统达到平衡。

王懿睿等[41]用全体液平衡反向透析法评价伊曲康唑自微乳化释药系统体外释放，能较好地模拟人体内释放的情况。按照ChP2020桨法测定样品释放度，搅拌桨转速100r·min^-1，水浴温度（37±0.5）℃，释放介质900mL，将7个装有2mL释放介质的大小、形状相同的透析袋，完全浸入释放介质中平衡2h。然后将相当于50mg伊曲康唑的伊曲康唑自微乳化释药系统直接放入释放介质中，分别于5、10、20、30、45、60、80min定时各取出1个透析袋，同时从释放介质中取出5mL并补充同温释放介质5mL。取出透析袋内溶液20μL进行HPLC分析，得到袋内药物浓度；取出抽取的释放介质用0.22μm的微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液20μL进行HPLC分析，得到袋外药物浓度。将透析袋内药物含量除以袋外药物含量得到累积释放度。Liu等[42]采用正向动态透析法和反向动态透析法研究了紫杉醇固体脂质纳米粒的体外释放行为，以pH6.0的0.8mol·L^-1水杨酸钠溶液为释放介质，结果显示，在0.5h内的释放量分别为27.6%和17.4%，可能与纳米粒表面吸附的药物快速解吸附有关，2条释放曲线均符合一级动力学方程，但反向动态透析法的速率更快，应与制剂直接加入到释放介质中能更好地模拟体内药物释放环境有关。

2.2.3 综合透析法

也有文献报道采用综合透析法进行药物体外释放度的测定[43]，透析法可以结合ChP标准溶出装置，包括桨法、篮法、小杯法、流通池法等，也可以结合简易方法如摇瓶法或烧杯搅拌法等一起使用。在这种方法中，将篮法中的“篮”替换为密封的透析膜，或者将一定孔隙的透析袋系在桨或篮上，并将待测物置于透析袋中，然后每隔一定时间于溶出杯中取出相应的药物释放溶液，测定体外释放度，也可通过对取样分离法、流通池法等装置进行改进，与透析法结合用于长效注射剂体外释放度评价。

Manna等[44]用透析膜结合桨法研究了布比卡因多囊脂质体（BPV-MVL）的体外释放，首先研究了布比卡因在各种MWCO膜（10、20、50、100kDa，再生纤维素，Float-A-LyzerG2；Spectrum Labs，CA，USA）上的扩散动力学。将每个透析膜（管）在0.5%SDS溶液中预润湿，并用去离子水洗涤以消除膜表面的甘油并获得最大的膜渗透性，将2mL1.5mg·mL^-1的布比卡因对照品溶液放到透析管中，然后将透析管固定在USPⅡ法仪器中。溶出介质为200mL PBS（pH7，50mmol·L^-1），温度为37℃，使用原位光纤UV-Vis系统测定布比卡因浓度。研究BPV MVL体外释放方法时的考察条件包括不同的温度、搅拌速度和pH，结果显示在所有释放条件下都观察到了明显的三相释放特性，释放曲线包括突释阶段、滞后阶段和二次释放阶段。张辛宁等[45]采用薄膜分散法制备紫杉醇衍生物脂质体，按照篮法与正向透析结合法进行体外释放测定，将脂质体溶液置于透析袋，两端封闭扎紧后置于溶出转篮，然后放入溶出杯，释放介质为0.5%聚山梨酯-80溶液1000mL，尽量保证有效释放透析袋长度一致，转速100r·min^-1，取样体积10mL，取出溶液经孔径0.45μm有机微孔滤膜过滤后检测。研究表明，该脂质体有一定缓释效果，释放速率显著低于对照组。Mottaleb等[46]将转篮改造成底部为透析膜的玻璃篮，用其比较了布洛芬脂质体、脂质纳米囊和纳米粒3种制剂的体外释放曲线，与具有较大膜表面积的透析袋相比，玻璃篮透析法可以辨别不同纳米制剂体外释放行为的差异。Yuan等[47]、Rudd等[48]使用流通池法结合透析装置，建立了多柔比星脂质体体外释放测定方法，通过优化介质中羟丙基-环糊精浓度、温度和待测样品浓度等参数，可以区分不同组成、不同理化性质和不同制备工艺所制备的多柔比星脂质体。

2.3 扩散池法

扩散池法是指采用扩散池装置，使用透析膜来测定长效注射剂中药物体外释放度的一种方法。Franz扩散池、Valia-Chien水平扩散池和流通扩散池常被用来测定纳米给药系统的药物体外释放度。

测定时，样品池中放置待测物混悬液，接收池为释放介质储存处，在不同时间点于接收池内取样测定释放度，并同时补充新鲜释放介质。与其他设备相比，该设备的操作过程不那么复杂，但接收池的体积有限，通常为12mL，需要更多的溶剂来满足沉降条件，此外，在搅拌过程中，有可能在受体室中形成气泡。Gupta等用垂直Franz扩散池检查奈帕芬胺眼用混悬液体外释放，同时使用流池法、摇瓶法、透析法进行了体外释放实验，结果表明，用流池法时释放曲线的结果最好且可重复。Herrera等同时用垂直Franz扩散池法和旋转瓶法检查醋酸亮丙瑞林缓释微球的体外释放，结果显示Franz扩散池法的药物释放曲线与体内结果更为相关。石玲玲等采用Franz扩散池法，比较奥泽沙星皮肤外用制剂试验制剂和参比制剂体外释放的一致性，以0.45μm聚醚砜膜为人工膜，7mL脱气后的二乙醇单乙醚-水（50∶50）为接收液，转速500r·min^-1，温度32℃，取样体积2mL，于0.5、1、2、4、6h取样，以HPLC法分别测定药物在人工膜中的释放量随时间变化的释放规律，评价试验和参比制剂体外释放的一致性。

2.4 其他方法

除了上述方法，也有文献[52]报道单滴法、倒杯法、孵育法在长效注射剂的体外释放度检查中的应用。Soderberg等[52]开发了单滴法来研究脂基制剂的体外药物释放，与水或释放介质相比，脂基制剂具有较低的密度，因此它们在介质中保持漂浮状态。在该方法中，制剂一直暴露在具有恒定面积的介质中，药物可以很容易地与介质平衡，但必须不要干扰组装，否则脂滴可能分解并黏在玻璃壁上。单滴法的主要缺点是不适合评价具有两亲性（亲脂性和亲水性）、高极性和低粘度特性的配方。有文献报道采用单滴法对利多卡因与普利卡因比例为1∶1的脂类长效注射剂进行体外释药研究，并实现体外IVIVC[53]。脂质或油基制剂的药物释放主要取决于制剂与介质之间的界面面积，这类制剂在溶解介质中需要保持恒定的表面积，以防止由于方法本身而引起的批次之间的变化。为了克服单滴法的局限性，Soderberg等[54]又开发了倒杯法，倒杯法可以防止脂基制剂分散在介质中，且不受待测制剂黏度和极性的影响。表3总结了本文中体外药物释放非药典方法的优缺点。

长效注射剂作为一类可延长药物作用时间，减少给药次数，改善患者顺应性的制剂，正在成为国内外新药研发的热点。开发者应结合原料药基本理化性质、药物靶点和作用机理、临床使用特点、目标应用人群等，全面分析选择长效注射剂作为目标制剂进行研发的合理性和可行性。将质量源于设计的理念融入整体开发策略，特别关注长效注射剂释放机制的设计与研究，基于释放机制建立质控前移的思路，研究体外释放方法。通过对已上市长效注射剂品种释放度方法的梳理，释放度取样时间一般达到3d以上，最长可达1个月以上[55]。与给药周期相比，一般释放度取样时间较给药周期短。长效注射剂研发者在释放度检测方法的开发过程中，一般希望能够建立IVIVC量化制剂在体内的释放和吸收，并作为有效的质控方法支持在临床开发的后期或上市后处方变更的生物等效性豁免。取样时间是体外释放度良好控制方法的重要参数，但由于药物在体内行为的复杂性及体外释放度方法的局限性，使得长效注射剂IVIVC的建立具有较大挑战，因此，研究筛选出取样时间短、稳定可靠的释放度方法，不仅可以减少试验时间和降低成本，也能够提高企业后续生产、放行的效率。