一文搞定制药设备清洁验证分析方法的开发与验证
清洁验证的好处在于可以识别和纠正可能危及药品安全性和有效性的潜在问题，应当在药品生命周期内持续考察清洁方法的有效性，药品生产企业应当定期进行清洁验证，持续完善清洁后的可接受标准，并建立有效的清洁检测措施。
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在医药产品的制造过程中，生产的产品质量必须始终如一。现行的良好生产规范规定清洁是确保产品质量的关键步骤。原料药和药品的生产涉及一系列的加工步骤和各种设备的使用，在特定的药品生产设备中进行清洁，以防止药品与其他活性成分（如非预期化合物或微生物污染）的交叉污染和掺假，可防止一些严重问题。清洁验证的好处在于可以识别和纠正可能危及药品安全性和有效性的潜在问题，应当在药品生命周期内持续考察清洁方法的有效性，药品生产企业应当定期进行清洁验证，持续完善清洁后的可接受标准，并建立有效的清洁检测措施。
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清洁验证研究的基本要素主要包括残留限值的制定，清洁程序（包括设备标识，产品特性，如活性、毒性、溶解度、剂量、批量等，以及清洁剂的特性），分析方法及其验证以及取样程序和必要的验证。
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清洁验证应证明，该程序能够始终将先前生产的物质的残余物去除到可接受的水平，并且清洁程序本身不会对设备造成不可接受的残留物水平。设定的限度应该是实际的、可实现的和合理的。在活性药物成分生产中，可能存在部分反应物和不需要的副产品，这些副产品可能未经化学鉴定，也就意味着这些物质的毒性是未知的。因此，这些物质也应当被予以关注，制药企业应基于合理的科学论证来决定哪些残留物需要被量化。
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清洁程序应足够详细，以消除清洁过程中任何不一致的可能性。在确定设备的最佳清洁程序时，必须结合要清除的产品残留物、可用的清洁剂和清洁技术对设备设计进行详细评估，（1）待评估的设备参数（待清洁设备的标识、难以清洁的区域、材料性质、是否易于拆卸、是否固定）；（2）待清洁残留物（清洁限度、残留物的溶解度、接触时间）；（3）待评估的清洁剂参数（最好是工艺中通常使用的物料、可用清洁剂（除非绝对需要，尽量减少清洁剂的使用）、溶解度特性、环境因素、健康和安全考虑）；（4）待评估清洁技术（手动清洗、在线清洗（Cleaning in Place，CIP）、离线清洗（Cleaning out of Place，COP）、半自动、自动、时间因素清洗循环次数）。
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用于检测残留物的分析方法应针对待分析的物质或物质类别（例如，产品残留物、赋形剂、分解产物、防腐剂、清洁剂残留物和/或内毒素），并在进行清洁验证研究之前进行验证。如果没有检测到污染或残留，并不意味着清洗后没有残留污染物。这只意味着样品中不存在高于分析方法灵敏度或检出限的污染物。清洁验证分析方法的基本要求如下：（1）方法的灵敏度应适用于计算得到的残留限值；（2）方法应实用、快速，并尽可能实用公司现有的仪器；（3）方法应根据ICH，中国药典，美国药典和欧洲药典要求进行验证；（4）分析方法开发应包括擦拭回收率的研究，以挑战取样和测试方法；（5）设备表面的材质类型不同，样品的吸附程度可能不一致，导致的擦拭回收情况存在差异；（6）样品取样和检测的时间间隔，可能会影响样品的稳定性。
清洁残留物的分析方法一般分为两种专属性分析方法和非专属性分析方法。专属性分析方法表示对特定的目标进行分析的方法，而非专属性分析方法则不能针对某一种化合物进行分析，表1中给出了常见的专属性和非专属性分析方法。目前各检查机构更加倾向于使用专属性分析方法，但并不意味非专属性分析方法不能够使用，在有充分的理由的情况下，非专属性分析方法也是可以被接受使用的。
目标残留物的测定有多种分析方法可以选择。选择用于测量残留物的分析方法与目标残留物的化学性质以及为残留物的允许残留限值密切相关。化学性质包括目标残留物是有机物还是无机物，溶于水或其他溶剂，其极性程度，以及在清洁环境中的稳定性。选择合适的分析方法的一个关键因素是方法产生的结果与目标残留物有逻辑、科学的联系。如果样品中的目标物是有机化合物，非电离的，那么使用电导率作为分析工具显然是不合适的，因为在分析样品中目标残留物的存在与测试样品中电导率的测量之间没有科学的关系。
通常情况下，一般优选专属性分析方法中的高效液相色谱法，高效液相色谱法能够准确的告诉我们残留药物的具体量，在药物活性较高时，这一点更加重要。高效液相色谱可以配备不同类型的检测器，以适应不同类型的物质检测，例如，紫外检测器，二极管阵列检测器，质谱检测器，蒸发光散射检测器以及折光检测器等等。目前大部分药物的含量分析方法都会选用高效液相色谱法，在含量分析方法开发时，尽量使灵敏度更高，这样可以直接应用于清洁验证的样品分析，避免再次开发新的分析方法。此外，HPLC方法还可以对稳定性较差的药物的降解产物进行分析，分析方法开发时可以同时开发药物活性成分和降解产物同时分析的方法。
非专属性分析方法通常是测量由各种化学物质的贡献所产生的总特性的方法。非专属性分析方法最常用的方法即总有机碳分析方法。总有机碳都提供了一个整体性质的测量，但没有提供关于有机碳来源的化学性质的信息。当该被用于一个目标残留物时，我们并不能知道残留量所对应的具体物质，但所获得的总量却可以告诉我们目标的残留物是否符合了允许的最低限值。总有机碳较高效液相色谱法相比有以下几个优点：（1）参数更加简单，方法开发时间短；（2）分析时间快，缩短检测时长，检测效率高；（3）可以同时监测药物活性成分、赋形剂、降解产物和消毒剂等物质；（4）此外，TOC在中药制剂、疫苗以及体外诊断制剂的清洁验证的应用中具有非常明显的优势。
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无论是专属性分析方法还是非专属性分析方法，在方法选定后，都应当按照现行的法规要求，对分析方法进行验证，确定分析方法可以满足预期的用途。清洁分析方法验证的参数通常包括：专属性、检测限与定量限、线性与范围、精密度（仪器精密度、重复性和中间精密度）、取样回收率以及溶液稳定性等。
专属性：清洁验证专属性分析方法相较于一般分析方法，存在更多的干扰因素，例如设备表面的洁净程度，棉签的干扰因素以及擦拭溶剂。在清洁分析中，除了活性成分，我们还要关注活性成分与各相关杂质以及存在响应的辅料峰的分离。在清洁分析方法研究中，如果存在干扰物质，则应尽可能将其与主峰分离，以避免方法不能准确定量。非专属性分析方法由于其不具备专属性，例如总有机碳，在此种情况下，应当保证空白检测结果的可重复性，使用空白检测结果对在残留物样品的检测结果进行校正。
检测限和定量限：专属性分析方法如果选用的是药物活性成分的含量分析方法，一般对照品浓度较高，并且法规和指南中不要求在含量方法的验证过程中进行检测限和定量限的研究，但清洁验证的目的是为了避免交叉污染的产生，所以浓度一般较含量分析方法相比要低很多，必须要进行检测限和定量限的研究，，以保证分析方法具有足够的灵敏度，可以有效的定量残留物质，一般采用信噪比方法进行研究，检测限取信噪比为3:1，定量限取信噪比为10:1。非专属性分析方法可以采用多次测定空白，获得空白值的标准偏差，再计算检测限和定量限。
线性是指在一定测定范围内，被测物质浓度与检测值成正比关系的程度。线性是定量实验的基础。线性的设计应满足预期使用范围。可以配制为储备溶液进行稀释，也可以分别精密度称量制备，但应至少制备5个浓度的溶液，并测定。以检测值和被测物质浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，判断在该范围内是否具有良好的线性关系。清洁验证中，线性的最低限应从LOQ开始，有时可能同一种物质存在不同剂型，其限度可能不一致，可以将线性的最高限应考虑覆盖更高的水平，使该方法可以同时应用于不同的剂型。
范围是指该分析方法使用的最低到最高浓度区间，应根据具体应用，最线性，精密度和准确度进行合理设计，确定方法的使用范围。
取样回收率：清洁分析方法的回收率的测试方式不同于一般的分析方法的回收率测试，清洁分析方法的回收率研究需要考虑擦试剂是否能有效的回收药物活性成分，以及棉签个数是否有响应。擦试剂一般选择水，乙醇，异丙醇以及乙醇或者异丙醇和水的不同比例的混合溶液，如采用其他溶剂，因其可能对生产设备造成污染，可能需要对此进行评估。提取溶剂如选择HPLC和UPLC方法，尽量和流动相相近，以减小溶剂效应对峰型的影响，如选取TOC法，则应使用水，TOC法的擦拭溶剂也只能选取水。由于在生产过程中物料会与不同的材质的生产设备相互接触，不同的材质对被测物的吸附能力可能存在差异，采用相同的擦拭回收方法，可能会出现取样回收结果不一致的情况，因此还应对被测物直接接触的不同材质进行准确度研究。由于清洁分析方法的特殊性，所以准确度要求同其他定量方法要更低，但应不低于50%，并应该采用校正因子的计算方式，将测定结果修正为实际结果。在回收率研究过程中，因为擦试剂体积会参与最终的计算，但蘸有擦试剂的棉签在擦拭设备表面时，擦试剂非常容易残留在设备表面，所以有的研究人员通过使用第二根或者第三根干的棉签进行回收，以保证药物活性物质可以被回收，研究过程见图1。
精密度：精密度考察分为三部分：仪器精密度，重复性和中间精密度。仪器精密度又分为日内精密度和日间精密度，采用对照品溶液，同一时间连续进样考察日内精密度，分别在不同天连续进样考察日间精密度。由于清洁验证分析方法的考察，就是人员是非常重要的因素，因为擦拭过程中人员的擦拭力度以及方式可能都会存在一些差异，所以需要进行中间精密度研究，由第二个实验人员进行重现，确保实验可以在不同人员操作的情况得以重现，并且清洁验证中残留物的取样人员应进行取样的培训。在清洁验证中，擦拭取样过程，对取样工具、擦拭溶剂、取样人员的操作等都有一定的要求，总的来说比较复杂。为保证方法举有良好的重现性。精密度试验必不可少，不仅要考察重复性，还要对不同人员的操作进行评估，因此中间精密度或重现性也是非常必要。同时还要对重复性和中间精度度或重现性的数据进行整体评估，确保在不同人以及不同情况下仍能保证取样过程的正确性。
溶液稳定性：对于清洁验证分析方法的研究，溶液稳定性的研究必不可少。一方面是取样的地方可能没有样品分析的仪器，需要到很远的地方法进行测定，另外一方面，清洁验证的过程并不一定是短时间内可以完成的，可能分为几个步骤分别进行，为了减少检测的成本，尽可能将样品在同一次实验中完成。对于不稳定的样品，我们需要对样品制备的方式或者样品的存储条件进行适当的调整，例如更换样品溶液的稀释剂或者将样品存储于5℃进行存放。
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根据清洁经验和设备设计确定难以清洁的设备位置（最坏情况）。样品表面积通常在25-100cm2之间变化，并且应足够大，以允许回收足以通过分析方法检测的残留量。研究所需的样品数量取决于各种因素，如设备表面积、材质、设计、形状和工作原理。考虑到设备产品接触面上残留物的均匀性，必须采集多个样品，包括最难清洁的位置。
取样是清洁方法验证的关键步骤。清洁方法验证采用了不同的取样方法。选择的取样方法都必须符合合理的科学判断，并且必须支持研究的目标，即证明设备中残留物数量已减少到可接受的水平。经典的取样方式分别为：直接表面取样（棉签擦拭法）和间接取样（冲淋取样法）。这两种方法的结合通常是最理想的，特别是在设备部件人难以接近进行直接表面取样的情况下，两种方法的比较见表表2。
上述内容对清洁验证的基本要素进行详细的阐述，这些内容还是远远不够的，还应当基于风险角度结合人机料法环五要素，见图2，针对具体产品和实际情况，设计最合理的清洁程序，保证清洁验证的成功。
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清洁验证是防止药品污染和交叉污染的重要手段，以避免药物成分之间潜在的临床显著协同作用，而稳健有效的清洁程序的实现是避免污染的主要方式，因此，应采取有效的清洁措施同时提供书面证据，证明所采用的清洁方法能够始终将产品（包括中间体和杂质、清洁剂和外来物质等）带入后续产品的潜在残留控制在预定水平以下，保证药品的安全性和纯度，进而保证了患者的用药安全。
撰稿人 | 药事纵横
责任编辑 | 邵丽竹
审核人 | 何发
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