制药人必看！质粒构建的基本流程

2023-08-23

质粒生物体中染色体或拟核以外的DNA分子，存在于细胞质中，它的特点为能够自主复制，并且使它的子代细胞中能够保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。

质粒

质粒生物体中染色体或拟核以外的DNA分子，存在于细胞质中，它的特点为能够自主复制，并且使它的子代细胞中能够保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的这个特点可以将质粒转入细胞中可以对基因的功能进行研究，可以表达我们想要的目的蛋白，也可以看我们导入的未来基因对这个细胞有什么影响。对细胞内的基因的表达有什么改变，所以说正确的质粒构建是实验成功的基础。

质粒构建

质粒构建说白了就是将我们得到一段想要的目的基因插入到对应的载体中形成一个一环状质粒。首先第一步是对质量构建方案进行设计，也就是引物设计，引物合成之后通过PCR的方法得到目的基因，然后将载体进行酶切变成线性化，之后通过DNA连接将目的片段将载体进行连接，然后转化到细胞当中进行培养，经过一段时间的培养之后，平板上会形成单菌落，我们将进行一个菌落筛选，对于筛选得到的阳性克隆进行扩大培养并且把质粒抽提出来，最后是进行质粒DNA构建的验证，包括DNA的测序验证，还有一部分是酶切验证。

引物设计

引物设计就是选择合适的引物能把模板上的目的基因给扩增出来，引物是成对出现的一条上游引物一条下游引物，引物与模板之间一定要有足够的重合区，一般≧15bp。这样这一条引物才能和模板结合，并将目标基因扩增出来。引物设计完成之后，通过PCR反应得到我们的目的片段。PCR反应首先是在PCR体系中加入模板DNA ，模板可以是质粒也可以是PCR产物，如果要扩增植物或动物DNA的话，可能要选做RNA提取。然后反转成CDMA做模板，然后上下游两条引物（F、R引物），通过DNA聚合酶催化反应，然后聚合酶的buffer给聚合酶提供合适的离子环境，然后用ddH2O做溶剂，整个PCR反就就是不断的经励变性、退火和延伸这三步。

变性

变性就是模板DNA双链解螺旋成单链，退火就是引物与模板单链结合，最后一步延伸就是游离的DNTP通过引物的确定方向，在DNA聚合酶的催化下扩增出不又链片段。然后经过多次循环，产生2的N次方的DNA片段。所以说PCR就是一个将目的片段扩大的过程，而且循环次数越多，后面的指数DNA的分子量是越多的。

在PCR得到目的片段之后，将PCR产物加上染料，进行琼脂（琼脂）糖电泳跑胶，对扩增后的条带进行切胶，切胶完了之后是使用DNA纯化回收试剂盒进行胶回收。这样就得到了我们的目的片段DNA，之后进行载体酶切。

酶切的体系

就是DNA质粒加上想选用的限制性核酸内切酶，加上内切酶buffer及ddH2O ，整个酶切的温度选择核酸内切酶的最适反应温度，大多数都是37摄氏度。

得到PCR产物和载体之后，下一步就是将目的片段和载体做一步连接。连接之后将连接产物转入到感受带细胞中，在质粒构建中所用的感受带绝大多数用的都是大肠杆菌，因为它有着像培养速度比较快、结构简单的特点。将连接产物转化到大肠杆菌感受带细胞当中之后，涂到培养基平板上进行培养，在平板上过夜培养。做一步菌落筛选，挑出平板上的单菌落放到培养基中进行扩大培养，之后进行菌落筛选，以菌液做为模板选择合适的引物进行扩增。

质粒进行验证

验证一般是分为两部分，一部分是微观的验证，也就是DNA测序。得到测序结果之后就是将测序结果与我们的目的序列进行比对。通过比对确认目的DNA序列是否存在插入缺失的情况发生。还有一步验证就是质粒的酶切验证，当我们的质粒构建完成之后会对它做一步酶切验证，从质粒上随机选两个酶切位点双酶切，看酶切之后的胶图是否与理论上的条带大小一致。

撰稿人 | 镐头2023 博普智库质量

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发

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