重组人源化胶原蛋白下游工艺解决方案

2023-02-06

人体胶原蛋白根据组织部位、生理功能、分子结构不同而分为28种以上胶原蛋白，含量比较高的主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原，不同型别的胶原蛋白功能与分布也大不相同。

重组人源化胶原蛋白简介

重组人源化胶原蛋白

人体胶原蛋白根据组织部位、生理功能、分子结构不同而分为28种以上胶原蛋白，含量比较高的主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原，不同型别的胶原蛋白功能与分布也大不相同。由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的部分氨基酸序列片段，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。目前市场上用于医疗器械及化妆品制备的重组人源化胶原蛋白主要是是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种。

重组类人胶原蛋白

由DNA重组技术制备的经设计、修饰后的特定基因编码的氨基酸序列或其片段，或是这类功能性氨基酸序列片段的组合。其基因编码序列或氨基酸序列与人胶原蛋白的基因编码序列或氨基酸序列同源性低。目前市场上用于化妆品的主要是重组类人胶原蛋白。

重组人源化胶原蛋白的”前世今生“

➤1940年: Astbury＆bell 猜想胶原蛋白是单链结构，开启了人胶原蛋白的研究历程。

➤1951年：Pauling＆Corey 认为胶原蛋白是对称三聚体。

➤1954年：Ramachandran＆Kartha 提出胶原蛋白右手三螺旋结构模型。

➤1972年：Okuyama获得（PPG）10拟胶原肽的晶体衍射数据。

➤1994年：Berman首个胶原蛋白模拟肽的三螺旋晶体结构。

➤1998年：Berman首个具有真正胶原序列的三螺旋晶体结构。

➤2000年：Liddington首个胶原蛋白复合体结构（结合整合素）

➤2018年：中国科学家首次解析0.15纳米人Ⅲ胶原蛋白（6A0A、6A0C）原子结构，被国际蛋白数据库（PDB）收录，正式开启了人源化胶原蛋白时代新纪元。

重组人源化胶原蛋白的应用

医疗器械领域

重组人源化胶原蛋白可用于制备止血材料、人工血管、骨修复材料、医用敷料等。弗若斯特沙利文数据显示，按零售额计算，2022-2027年，我国重组人源化胶原蛋白产品的市场规模将以42.4%的复合年增长率从185亿元增至1083亿元，重组胶原蛋白作为高成长、高潜力再生材料已然成为炙手可热的美业新风口。

化妆品领域

重组人源化胶原蛋白具有养护皮肤、修复敏感肌、祛除皱纹等功效，可用于制造面膜、喷雾、唇膏等产品。2021年，我国重组胶原蛋白功效护肤品市场规模达到45.6亿元左右。

重组人源化胶原蛋白生产工艺

重组人源化胶原蛋白用于医疗器械和化妆品遵循不同的生产体系标准和行业监管规范。重组人源化胶原蛋白的生产工艺主要取决于其用途，且生产工艺的不同主要是下游分离纯化工艺的差异。

用于医疗器械：

其生产及经营遵循医疗器械监管条例，采GMP生产标准。2023年1月28日，国家药品监督管理局发布了YY/T1888-2023《重组人源化胶原蛋白》医疗器械行业标准的公告（2023年第14号）

用于化妆品

采用化妆品的生产和监管条例，标签中禁止明示或暗示产品具有医疗作用，无硬性生产要求。

生产工艺

用DNA重组技术，将人源胶原蛋白基因克隆，并转化进大肠杆菌或者酵母菌中，通过发酵表达的方式生产重组人源化胶原蛋白原液，原液热处理（通常60-65℃水浴，10-30min）灭活发酵中产生的蛋白酶，原液热处理后在根据用途用盐析或者层析的方法进行纯化，并用10-30KD的UF/DF TFF膜组件进行浓缩，置换缓冲液，脱盐等，最后经0.22um微滤膜组件进行除菌过滤制备而成。

重组人源化胶蛋白下游工艺解决方案

下游工艺过程主要杂质

发酵过程产生的蛋白酶：主要通过热处理的方式灭活，同时在下游工艺过程中也可以添加广谱蛋白酶抑制剂。

原液中HCP，HC-DNA，HC-RNA：主要通过盐析或者层析的方式去除，盐析去除效率远低于层析技术。

分泌表达的原液中培养基组份：主要通过UF/DF的方式去除。

原液中的内毒素：主要通过AEX方式去除。

原液及上游工艺中产生聚集体及片段：主要通过层析的方式去除。

亲和标签的去除：

1. 酶切后通过SEC的方式去除。

2. 亲和层析:在亲和层析时，标签重组人源化胶原蛋白和IMAC等AC结合后，先进行酶切，酶切后标签结合在AC柱床上，而重组人源化胶原蛋白停留在柱床中但未和AC结合，用盐溶液将其林洗下来而实现标签和重组蛋白的分离。

微生物：通过0.22um膜过滤的方式去除。

下游工艺解决方案（用于化妆品）

1. 重组酵母菌分泌表达：固液分离（离心）——热处理(60-65℃水浴，主要灭活蛋白酶及使部分HCP变性)——盐析——溶解——UF/DF（常用10-30KD TFF膜组件，脱盐及置换缓冲液）——AEC（流穿模式，去内毒素）——过滤除菌（0.22um）

2. 重组大肠杆菌胞浆可溶表达：收集菌体（离心）——菌体洗涤，重悬，破碎——热处理（同上）——固液分离及澄清（0.22-0.65um微滤膜组件）——AC(IMAC,在基因克隆时，His-tag加N端和C端几乎都没有影响)——SEC（脱盐）或者UF/DF。

下游工艺解决方案（用于医疗器械）

1. 重组酵母菌分泌表达：热处理（同上）——固液分离（离心）——澄清（0.22-0.65um微滤膜组件）——UF/DF（常用10-30KD TFF膜组件，浓缩及置换缓冲液，同时去除培养基组分及部分HCP）——CEX/MMC（捕获）——AEC（去内毒素）——除菌过滤（0.22um膜过滤）

2. 重组大肠杆菌胞内可溶表达:固液分离（离心收集菌体）——菌体洗涤，重悬，破碎（重悬缓冲液和IMAC结合缓冲液一致）——热处理（同上）——澄清（0.22-0.65um微滤膜组件）——捕获AC（IMAC,在基因克隆时，His-tag加在C端同时加linker(G4S)n）——酶切（切除His-tag）——SEC（去除酶切后重组人源化胶原蛋白中的His-tag,同时置换缓冲液）——AEX（流穿模式，去内毒素）——UF/DF(置换缓冲液并调整浓度)——除菌过滤（0.22um膜），此工艺亲和标签的去除也可以用亲和层析去除（见上文亲和标签的去除）

重组人源化胶原蛋白纯化常用层析填料：

CEX：CM Seplife FF/XL用于大肠杆菌胞内可溶表达的重组人源化胶原蛋白快速捕获，CM填料不适合原液中离子强度偏高的样品。

MMC：MMC Large Scale/Large Scale HP用于酵母分泌表达的重组人源化胶原蛋白的快速捕获，MMC多模式弱阳离子复合模式填料对于含有中等离子强度（约100-300Mm NaCl）的原液无需脱盐可直接捕获结合。

AEX：Q Seplife FF/XL用于精纯阶段内毒素的去除。

SEC：Seplife S-100用于亲和标签切除后，亲和标签的去除。

AC：主要是IMAC里面的Ni Seplife FF(NTA)，用于活性及变性条件下His-tag标签蛋白捕获及纯化，同时也用于柱上亲和标签的切除和去除。