一份非常有趣的报告介绍了 Kymriah CAR-T 从学术界到工业生产的转变，以及在过程控制、自动化、向封闭系统的转变、分析以及 GMP 慢病毒生产和其它优化方面的影响。

鉴于其前所未有的临床价值，我们将看到细胞疗法在未来几年内得到更大规模的部署，我们预计研发、PD 和生产中使用的方案和工具包将在此过程中发生重大变化。框 2 讨论了规模、产能和成本考虑因素。除了用于免疫细胞培养的、已建立生物反应器系统之外，行业还引入了新的培养方式，包括微流控和封装，每种方式都具有独特的潜在优势。我们将简要讨论体外细胞工程的替代方案，它可以改变生产格局。尽管如此，由于一些优势和广泛的临床试验管线，我们预计体外策略在未来几年仍将是一种重要的细胞治疗方式，我们将对比三种自动化和工业化方法。然后介绍细胞分离和筛选以及分析方面的创新。

新的培养形式

除了用于贴壁细胞（扁平器皿、固定床）和悬浮驯化细胞（用于批次模式或灌流的搅拌罐生物反应器）的现有细胞培养系统之外，许多新的、可能更有效的培养系统正在出现。

微流控

在过去的二十年里，微流控技术在研究、分析、诊断和合成方面有许多应用。当用于细胞培养时，自动微量流体操作可以精细控制细胞微环境，并可以产生高局部浓度和小距离，从而优化试剂向细胞的扩散（图 6 A）。由于更好地控制工艺参数，细胞几乎可以均匀地获得溶解的气体和营养物质，从而实现更均匀的细胞扩增。旁分泌作用在较高的细胞密度下也更有效，从而改善细胞通讯；这可以导致更高效率的工艺，因为许多细胞过程，如增殖、分化和调节，在很大程度上依赖于细胞如何感知和响应它们的微环境。由聚合物制成的一次性培养芯片和组件可以使用注塑成型、热成型、激光切割、机械加工、热压或精密卷绕处理等技术进行批量生产。也可以使用积层制造（3D 打印）。

图 6 为细胞治疗培养细胞的新微环境。A) 微流控方法：微流控将反应器的特征尺寸缩小到几个细胞的规模，这可以增加对微环境参数的控制，同时允许轻松连接到其它基于微流控的组件。B) 封装：封装也可以起到同样的作用，但可以在海藻酸盐等聚合物中保护细胞，使细胞小群体(球体)或大群体(纤维)生长，然后可以在标准的3D生物反应器中培养，如搅拌罐反应器(STR)。

先进的实验设计 (DOE) 可以在并行芯片中以比 Sartorius 的 Ambr 15 mL 生物反应器或 Erbi Biosystems（美国马萨诸塞州斯托纳姆）的2 mL 生物反应器体积大 10-100 倍的产品更快且更具成本效益的方式实施。从工艺开发到生产使用微流控的一个好处是，早期检测的输出可以直接用于通过规模扩展在相同类型的芯片中生产更大量的产品。

包括 MicrofluidX（英国伦敦）、Astraveus（法国巴黎）和最近的 Sarcura（奥地利维也纳）在内的公司正处于为 CGT 生产开发一系列专有微流控架构的相对早期阶段。例如，MicrofluidX优化了原代 T 细胞转导，与传统系统相比，专有微流控芯片的效率提高了近 3-4 倍，英国Cell and Gene Therapy Catapult进行了独立验证，并与基于不同实验室的微流控系统的独立报告一致。

该公司计划将具有 30 个独立盒式反应器的研究和工艺开发设备商业化，并通过在线过程分析技术 (PAT) 实现全自动化，包括“细胞成像、计数、pH、溶氧和代谢物”。MicrofluidX 还开发了一个 GMP 平台，可部署在低级别的洁净室中，“在不到 2 平方米的空间内最多可安装 100 个独立的高精度 200 mL/400 cm² 灌流生物反应器”。这些细胞在两种设备的相同微环境中生长，因此规模扩展预计是“瞬时”的。该系统有望生成大量有价值的数据，并且 GMP 平台的集合可以跨站点分布，同时仍然集中控制。

如果这种微流控方法有效，它可以提供范式转变，并且需要进一步研究：预计在 2026 年之前不会出现第一个可用于 GMP 生产的完全商业化的、基于微流控的设备。

至关重要的是，使用微流控形式进行细胞培养（例如 CAR-T 扩增）将简化连接并促进与其它基于微流控的组件（例如细胞分选或灌装系统）的集成。

从发现到生产，一旦芯片容量和系统级性能得到确认，就必须评估规模放大以生产 100 x10^6至1,000x10^6细胞的成本。由于体积限制，可以想象基于微流控的方法的最佳点将是自体细胞疗法，它需要 10 x 10^6到 1,000 x 10^6 细胞，而不是需要 >10,000 x 10^6细胞的疗法，例如一些肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)、一些 T 细胞受体T 细胞 (TCR-T) 和一些实体瘤 CAR-T，或异体细胞疗法。或者，它可以在更传统的生物反应器中的扩增过程之前使用，但会失去一些优势。

封装

除了微流控，正在开发基于生物相容性聚合物中的细胞封装的方法。 TreeFrog Therapeutics（法国波尔多）开发了一种培养系统，将细胞封装在 ~200 mm 藻酸盐珠中，见图 6B。这些珠子使细胞能够适应 3D 和标准搅拌罐生物反应器，这些细胞通常仅在 2D 中生长并且通常会在搅拌罐生物反应器 (STBR) 中受到应激。细胞长成微组织，这对大多数 iPSC 应用都是有利的。iPSC 的性能显著高于传统系统的性能。最近，该公司与 Umoja（美国华盛顿州西雅图）合作，利用 Umoja 的细胞工程技术（例如引入雷帕霉素激活细胞因子受体（RACR）以实现分化），在不含细胞因子和滋养细胞的条件下，将 iPSC 分化为自然杀伤（NK）细胞等免疫细胞。该合作伙伴关系的目标是创造具有更高安全性和持久性的异体免疫细胞疗法。

Celvivo（丹麦欧登塞）也在球状体中使用 3D 细胞封装，但在具有受控 CO2 和温度的回转器中。由旋转生物反应器组成的回转器的目标是创造微重力条件，使氧气、营养物质和代谢废物扩散，而不会使细胞暴露于剪切应力。

值得注意的是，原则上，基于球状体的封装系统可以与我们之前描述的微流控装置相结合，类似于 Xilis（美国北卡罗莱纳州达勒姆）或 Okomera（法国巴黎）等公司目前使用患者来源的类器官进行研发和功能性个性化医疗所做的事情。然而，这可能会导致较低的密度，从而将应用限制在生产规模的极低端。

CellFiber（日本东京）开发了另一种封装系统。它也使用藻酸盐，但这次以长纤维的形式挤出，细胞在其中生长。该公司报告在 10 天内将 2000 万个细胞扩增到 300 亿个，并且最近与经验丰富的工程团队 The Technology Partnership (TTP)（英国剑桥）合作，为 iPSC、MSC、T 细胞和 NK 开发一种新的可放大且价格合理的生产系统细胞。

其它系统

在 Sepragen 的 Express 生物反应器中，贴壁或悬浮细胞在类似于蜂箱的一次性海绵状基质中生长。通过增加表面积和氧气可用性，该公司表示可以获得 5 倍或更多的生产率提高。Cellevate 是一家早期阶段公司，正在开发另一种基于其专利纳米纤维微载体的 3D 基质。

Cellino（美国马萨诸塞州剑桥市）正在构建用于个性化细胞治疗的高通量自体细胞重编程平台。该公司表示它使用无标签成像、ML 和激光编辑来重新编程、扩增和区分完全封闭的盒中的数千个独立剂量。

PBS Biotech（美国加州卡马里奥）以一次性垂直轮生物反应器的形式出售一种不同的系统，特别适用于 iPSC 的培养。与标准搅拌罐生物反应器相比，U 形容器和垂直轮可最大限度地减少剪切力，有利于均匀混合并促进规模放大，因为与其它几何形状相比，小体积生物反应器中的流体动力学条件更容易转化至更大的系统。该公司介绍可在 20 天内生产 500 亿个细胞，并且最近与 Stemcell Technologies 签署了供应合作伙伴关系，以向研究人员提供其 MINI 生物反应器。

随着这些系统的成熟，需要一个精确的基准来比较它们在一些有代表性的工艺和细胞类型中的作用，以指导细胞疗法开发人员的选择，而不仅是他们可以从营销材料和孤立研究中学到的东西。

原文：J. Sylvestre, P. Conti-Permanne, Emerging technologies & companies in cell & gene therapy manufacturing. Cell & Gene Therapy Insights 2022; 8(11), 1601–1649.