抗体药物生物学活性检测的ELISA高通量方法

2022-11-30

ELISA和流式细胞术是目前检测抗体活性中常用的两种方法。如ELISA检测抗原抗体结合亲和力，一般将抗体与系列稀释的抗原一同在溶液中温育，进行抗原-抗体反应。当反应达到平衡后，将溶液移至包被有相同固相抗原的聚苯乙烯微板中，进行接下来的酶标二抗的孵育和显色。测得的OD值结合梯度稀释的抗原浓度绘制拟合曲线，最终找到最强信号一半的点，通过 IC50 值评价抗体的抗原结合能力。

抗体药物的主要作用机制是通过Fab区与疾病相关的靶细胞抗原发生特异性结合，再通过Fc区发挥一系列的效应功能，包括Fc区域通过结合主要是NK细胞上的FcγRIII（CD16A）引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCC）；与血清补体分子（C1q）结合，继而形成膜攻击复合物（MAC）引发补体依赖的细胞毒作用（CDC）；与巨噬细胞上的FcγRIII（CD16A），FcγRII（CD32A）和FcγRI（CD64）结合，可引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP），进而起到治疗的作用。有结合才会有功能，有功能一定有结合，结合和功能是抗体活性检测中最重要的两部分，所以在生物药前期研发阶段，包括细胞系建立的阶段，需要对抗体类药物的活性进行测定，以确保抗体类药物的有效性。

Mécanismes d’action et toxicités potentielles

des anticorps monoclonaux

Med Sci (Paris) 2019 ; 35: 1114–1120

一般用亲和力来表示抗体与靶点分子结合的情况，它是可逆反应过程中抗原、抗体和抗原-抗体复合物之间的相对状态的特征参数。对于抗体药物的效应功能测定，一般是基于细胞功能的检测，如检测细胞信号转导过程中关键生物标记物的信号；对引起细胞应答的转录和翻译水平的测定；以整个细胞为对象测定细胞的增殖或者死亡。

ELISA的主要操作步骤

但是ELISA步骤繁多，有大量的移液、清洗步骤，靠人工操作，难免会出现移液体积不准、漏加等人工操作误差导致的信号弱或者过饱和，以及标准曲线线性不佳、污染等问题。丹纳赫生命科学拥有自动化工作站结合酶标仪的整合方案，可以自动化地对样本进行高通量的ELISA操作，最大程度避免实验误差及重复的人工劳动。

自动化工作站进行ELISA实验流程

自动化工作站进行ELISA实验的结果

另外，还可以利用酶标仪的荧光偏振(FP)功能结合ValitaTiTER 试剂实现快速、均相、精确地对IgG Fc 结合产量进行有效评价。荧光偏振是一项广泛用于监测不断变化的结合事件的技术，可用于评估包括蛋白-抗体结合和 DNA 杂交在内的生物分子相互作用以及酶活性。通过平面偏振光激发的荧光标记小分子（示踪剂）可发射消偏振程度最高的光，这是因为示踪剂在激发与发射之间的间隔时间里快速减少。但当示踪剂结合一个比之大得多的分子时，它的旋转速度就会变慢，同时发射光仍然有大部分产生偏振。

在96 孔微滴度板的每个孔中，都包被有荧光标记的 IgG 结合多肽蛋白 G。当加入样品到孔板中时，蛋白G 分子被重悬并发生结合。一旦结合抗体，蛋白 G 分子的运动速率便会下降，导致荧光偏振 ( FP ) 值的增加。