这些构象通常是由弱的非共价相互作用驱动的，例如静电相互作用、氢键、疏水作用或范德华力。此外，双亲短肽由于肽单体之间的分子间弱相互作用而易于自组装。 化学的进步为分子设计提供了一种程序设计和控制的环境：本文将重点论述细胞穿透肽（Cell Penetrating Peptides, CPPs）分子设计方面的最新进展。

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细胞穿透肽的应用及化学结构特征

细胞穿透肽是一类长约5~30个氨基酸的短肽，能够携带多肽，核酸，小分子药物及病毒颗粒穿透细胞膜进入细胞。人们用其作为载体，将运载物转运进入细胞。过去的研究证明，用细胞穿透肽携带蛋白质和多肽治疗癌症和炎症性疾病的小鼠模型是有效的。基于动物实验研究，人们认为细胞穿透肽携带DNA或SiRNA治疗疾病将成为可能。

细胞穿透肽还可以提高病毒转染的效率。因此，对于这种即可帮助治疗疾病，又有可能助纣为虐，加速病毒传播的双刃剑，人们更需要加大研究力度以趋利避害。另外，细胞穿透肽可以携带荧光或放射性试剂用于成像应用。总之，细胞穿透肽携带治疗基因或者药物分子进入细胞将有非常广阔的临床应用前景。

细胞穿透肽数据库于 2012 年建立，由印度 Indraprastha Institue of Information Technology创建，现已更新至2.0 版，对于细胞穿透肽的分子设计具有很强的指导作用。细胞穿透肽数据库显示了 1699 个独特的细胞穿透肽序列，大多数是直链多肽（94.5%）。携带分子方面主要用于荧光团的传递 (54%)  ，与生物医学相关的主要货物分子是核酸（15%）。其余的货物分子主要包括蛋白质 (9%)、生物素（8%）、纳米粒子 (7%) 和肽药物(4%) 。细胞穿透肽的研究主体集中在全L-氨基酸 (84.3%) 构成的合成多肽(54.8%) 。此外，全D-氨基酸组成的细胞穿透肽的内化效率和稳定性，以及由 L- 和 D-氨基酸混合组成的细胞穿透肽，也有相关的文献报道。（图 1）

图1. 细胞穿透肽数据图

常规的细胞穿透肽的分子设计都绕不开以下三个关键参数：胍基含量（或者阳离子氨基酸含量）、疏水性和双亲性。富含精氨酸（精氨酸侧链为胍基，pKa约为12，在生理pH条件下为质子化的胍基阳离子）的细胞穿透肽，在一级结构-功效领域经受了深入的研究。

在研究细胞穿透肽的氨基酸序列以及单个氨基酸残基（例如正电荷）贡献方面，膜模型，膜提取物以及体内研究起到非常关键的角色，这些研究都对细胞穿透肽的分子设计起到了指导作用。尽管存在这些理论指导，单从多肽序列预测它的膜穿透性仍然非常困难。

除了序列之外。多种化学和物理化学性质，例如电荷、手性、芳香性和疏水性，及其相互作用通常是细胞穿透肽内化的重要驱动力。可以说，多肽序列是基础，在这个基础之上的分子间的相互作用，决定了细胞穿透肽的功效。要设计出高效的细胞穿透肽，包括电荷、胍基、手性、疏水性和芳香性在内的众多参数，它们之间的相互作用，需进一步的深入研究。

基于以上考虑，细胞穿透肽的构效关系和双亲多肽的空间构象得到了充分的研究。电荷与双亲性是细胞穿透肽分子设计时需要考虑的两个主要因素。细胞穿透肽的内化效果会因双亲性和多阳离子的整体特性而发生变化。除此之外，多肽序列长度与空间构象对于多肽内化有着与多阳离子性同等重要的地位。

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富集阳离子对细胞穿透肽的意义

富含侧链阳离子氨基酸的肽序列在细胞穿透肽领域可谓至关重要。Tat肽（图2） 的发现，是细胞穿透肽领域具有里程碑意义的事件。Tat (反式激活转录激活剂, Transactivating transcriptional activator) 肽是人类免疫缺陷病毒 (HIV-1)的原始转录激活因子中残基 48 至 60 的肽片段。Tat 改性的基因传递系统显示出增强的跨多个生物膜（例如细胞膜、内体膜和核膜）的转运功能。

 

图2. Tat肽化学结构

Tat肽包含六个精氨酸和两个赖氨酸残基，它们都属于碱性氨基酸，侧链分别为胍基和氨基，在生理pH条件下都因质子化带有正电荷。鉴于Tat的重大指导意义，最简单的细胞穿透肽模拟物设计为寡聚精氨酸也就不足为奇了。

细胞穿透肽的内化效果与阳离子残基之间的相关性已经得到了证实。受到Tat (GRKKRRQRRRPQ) 和渗透素(RQIKIWFQNRRMKWKK) 的启发，细胞穿透肽的分子设计主要集中在小的阳离子肽（携带5个左右的正电荷），例如聚精氨酸和聚赖氨酸肽。研究最深入的细胞穿透肽模型，是基于寡精氨酸的R8 和 R9 （8个或9个连续精氨酸残基的多肽，图3）。

聚阳离子细胞穿透肽的吸收效率取决于序列长度以及精氨酸残基在多肽序列的位置。据报道环化可最大限度地增加精氨酸与细胞膜之间的作用，从而实现更高的吸收效率。除了精氨酸侧链的胍基之外，多肽所带的正电荷也可以通过其他氨基酸侧链引入，例如赖氨酸（侧链氨基）和组氨酸（侧链咪唑基）。然而，聚精氨酸的内化表现优于聚赖氨酸和聚组氨酸 。因此，就内化和引入机制而言，聚精氨酸也是研究最深入细胞穿透多肽。线性聚精氨酸的内化效率取决于序列长度以及精氨酸残基的数量和位置。胍基团具有与膜之间形成双齿氢键的能力膜，因此其多肽内化应该与膜易位相关（图4）。

 

图3. R8/9多肽化学结构

 

图4. 精氨酸与赖氨酸同细胞膜表面磷脂基团形成的双齿和单齿氢键示意图。

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疏水性和芳香性结构

对细胞穿透肽的意义

除了阳离子部分，亲脂性部分对细胞吸收也很重要。对此，研究者提出了一种机制，认为富含胍基的细胞穿透肽，其主链附近形成了疏水性的反（阴）离子，对于细胞穿透肽的内化起到作用。反离子效应首先表现为精氨酸残基与膜组分之间的氢键相互作用，形成能够穿过膜的复合物 。与此形成对比的是，富含赖氨酸的多肽中没有观察到这种强烈的反离子结合，这一发现反向证明了胍基反离子对于促进细胞穿透肽内化的相关性。细胞穿透肽这种与疏水性反离子结合的特性称为这些肽的自激活特性。因此在关注多肽携带正电荷的同时，不可忽略细胞穿透肽疏水性研究，以及单一脂肪和芳香官能团的贡献。

疏水性可以通过添加脂肪族或芳香族结构来实现。一些细胞穿透肽模拟物的研究证实，芳香族活化性优于脂肪族。  脂化是通过将不同长度的烃链（烷基）连接到已知细胞穿透肽的N端 或其它合适的官能团上。这种烷基化改性通过增强与膜的疏水相互作用提高细胞穿透肽的内化效果。除了整合脂肪链外，多肽分子疏水性的提高也可以通过引入疏水性氨基酸（例如亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸）来实现。有报道称，在使用更疏水的丁基替换甲基之后，一个细胞穿透肽的活性提升了三倍。8 与之相应的是，在同一项研究中，当 γ-dimethylsilaproline取代脯氨酸Pro构建一个具有聚脯氨酸PPII螺旋结构的细胞穿透肽 （图5），其内化效率得到了提高。这个结果可能归结于多肽整体疏水性增加。

 

图5. 脯氨酸与γ-dimethylsilaproline化学结构

最近报道了一个具有细胞穿透特性的疏水性病毒肽gH 625（序列：HGLASTLTRWAHYNALIRAF，图6）。  这种细胞穿透肽的设计来源于单纯疱疹病毒I 型，用于运载脂质体 、量子点 、树枝状大分子 、无序蛋白质 和 SPIONS (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles, 超顺磁性氧化铁纳米粒子)。其化学结构的双亲性也得到明显体现。

 

图6. Gh 625疏水性细胞穿透肽结构（红色部分为疏水性氨基酸残基）

多肽疏水性也可以通过芳香族氨基酸残基（色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的引入得以增强。根据 Wimley 和 White 的说法，芳香族残基在多肽插入细胞膜双层界面的过程中具有优势的自由能。芘、晕苯和富勒烯被证明可以激发胍基阳离子的活化，从而使富含精氨酸的细胞穿透肽穿越细胞膜。

研究者又通过一系列实验验证，在保持多肽疏水性相同的前提下，芳香族官能团是否比脂肪族官能团提供更好的内化效率。这些研究发现，相较于脂肪链来说，芳香官能团更有助于细胞穿透肽的内化。因为芳香族多肽可以同膜蛋白上的芳香氨基酸产生π-π 作用，它们可能有助于促进或稳定 多肽与膜的相互作用并帮助内化。8这个概念被扩展至各种 π作用（π-π、π-阳离子、π-阴离子 和 π-偶极）对于多肽分子内化的影响。

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阳离子与疏水结构的综合考虑

在细胞渗透肽的分子设计中，阳离子与疏水性特征需要综合考虑。渗透素多肽（penetratin）就是这样的例子（图7）。渗透素是从一个果蝇同源域蛋白中得到的。渗透素与质膜的非极性部分的非静电相互作用对于内化很重要（这也解释了双亲分子设计的基础，渗透中包含亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等非极性氨基酸残基）。阳离子残基的数量、它们在一级结构上的间距，在二级结构上的相对位置，以及包含非肽元素（例如疏水性脂质部分）的整合，对于细胞穿透肽的分子设计非常关键。  

 

图7. 渗透素化学结构（蓝色为带阳离子的氨基酸残基，红色部分为疏水结构）

另一个例子是 Pep-1，它包括5个色氨酸（疏水性氨基酸，以增强多肽与细胞膜的疏水性作用）和带正电荷的富含赖氨酸的片段 (KKKRKV,来自于病毒SV-40 T-抗原上的核定位序列nuclear localization sequence), 以及一个脯氨酸间隔，以增加多肽的柔性。

同样，MPG肽 (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV) 的设计理念是包含相同的亲水性核定位序列，并将该序列与HIV-gp-41病毒片段的一个疏水序列偶合所得。把阳离子氨基酸残基、疏水性片段，以及双亲结构以不同的方式整合在同一多肽分子中，就可以构造和衍生出更多高效的细胞穿透肽。

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半胱氨酸细胞穿透肽

面对细胞穿透肽功能实现过程中的种种挑战，诸如内化效率，内体逃逸效率、循环时间，以及特异性和选择性方面（对于细胞、组织、疾病）的问题，细胞穿透肽设计已取得了相应的进展。其中的一个例子是富含半胱氨酸 (Cys) 的细胞穿透肽。

该分子设计的灵感来自于在蛇毒中发现的一种毒素克罗胺 （Crotamine，图8），它包含两个核定位域（crot（2-18）和crot（27-39））。通过检查crot（27-39）(序列：KMDCRWRWKCCKK)，研究者利用氨基酸残基的系统替换和/或省略，以及深入的构效研究，设计出一种富含半胱氨酸的十肽 (CRWRWKCCKK) 分子（图9）。这种潜在的细胞穿透肽具有增强的内化效率。

图8. 克罗胺Crotamine蛋白结构（图片来源：PDB: 1H5O）

 

图9. 克罗胺Crotamine核定位片段Crot (27-39) (上图) 与细胞穿透十肽（下图）分子结构对比（蓝色为保留部分）。

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单环、双环和三环细胞穿透肽

细胞穿透肽已成为细胞内治疗剂的热门研究领域。因为直链细胞穿透肽的天然限制，诸如内体包埋、毒性、细胞特异性差、稳定性差和降解性强，以及不完美的细胞渗透， 改性的细胞穿透环肽应运而生。相对于其直链前体，细胞穿透环肽具有增强的细胞穿透能力和改善的物化性质，以及抵抗水解降解的稳定性。一些细胞穿透环肽可以表现出不依赖内体的摄取的特质， 已报道了一些细胞穿透环肽具有核瞄准特性。 

图10展示了一些具有精氨酸和其它氨基酸 残基的单环、双环、三环结构的细胞穿透环肽。

图10. 包含精氨酸与色氨酸残基的单环、双环、三环细胞穿透环肽的化学结构。

[WR]4 和 [WR]5两个细胞穿透环肽结构单元的特征表现在交替正电荷（精氨酸）与疏水性氨基酸（色氨酸）在序列中的出现。含有色氨酸和精氨酸残基的单环细胞穿透环肽也可与潜在的治疗药物偶联。例如，单环肽与多柔比星、紫杉醇和喜树碱偶合， 其中多柔比星-环肽的加合物展示了内化作用的效果。

除此之外，几种含有半胱氨酸和精氨酸残基的单环肽，也显著增强了细胞对不可渗透的磷酸肽（F')-Gly-(pTyr)-Glu-Glu-Ile (F'-GpYEEI)的吸收。含有色氨酸和组氨酸的环十肽有效增加了细胞不可渗透的磷酸肽与抗 HIV 药物恩曲他滨（emtricitabine）的细胞内传递。 [WR]4-[WR]4-[WR]4 三环肽含有交替的精氨酸与色氨酸残基，它提高了 F'-GpYEEI 和荧光标记的抗 HIV 药物 (拉米夫定 (3TC)、恩曲他滨 (FTC) 和 siRNA) 的乳腺癌细胞系 MDA-MB-231的细胞摄取。 

在以上的细胞穿透环肽中，色氨酸和精氨酸残基的连续排列组合，衍生出了具有不同细胞传递特性的不同类型细胞穿透环肽。这些数据揭示了单环、双环和三环细胞穿透肽的分子运输潜力，并为设计下一代药物递送肽提供了良好的基础。

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总结

需要注意的是，本文在讨论细胞穿透肽的分子设计时，只介绍了多肽一级结构，也就是氨基酸序列方面的影响。由于篇幅原因，暂时没有介绍二级结构对于细胞穿透肽的活性。

尽管目前文献报道的细胞穿透肽的分子设计非常详尽，但将其转化为临床环境仍然是一个艰巨的挑战。细胞穿透肽的应用领域广阔且在不断发展，更深入的机理探索导致了分子设计复杂性的增加。这其中包括开发稳定并且多域的环状或自组装纳米结构。此外，选择性、靶向性、高效率等方面也需要进一步发展。许多研究人员提出了通过可控的空间折叠、环化、二聚、订合、自组装，甚至不同主链的多肽模拟物的方式，以达到提高细胞穿透肽的稳定性和活性的目的。

然而，由于各种复杂内化机理的研究发展，疾病的异质性，以及可用于体外研究的细胞系种类繁多，时至今日仍然没有统一标准，来评估一种分子设计相对于另一种设计的内化效率改进。此外，庞大的异质性货物分子意味着，在评估细胞穿透肽的效率与活性的过程中，需要考虑更多的参数。在这方面，需要标准化的统一以及更多深入对比研究，以度量不同类型的细胞穿透肽的表现。虽然细胞穿透肽设计已经取得了巨大的进步，但在这一领域无疑仍有很广阔的发展空间。

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