定制化大孔填料在生物大分子纯化中的应用优势

2022-10-24

近十多年来，生物技术产业的一个显著特点是超大分子药物达到突飞猛进的发展。创新的大分子药物，如IgM分子、蛋白三聚体、新型VLP疫苗和各种基因病毒载体，它们的分子尺寸能达到纳米级，而传统的填料孔道较小，一般在20-40nm范围内。

生物大分子进出填料的阻力增大、分离时间增长，致使层析柱的分离性能明显降低。常规孔径填料只能依靠填料微球表面吸附，为了增加可及比表面积，迫不得已采用更小粒径的层析填料，而这也同时增加了层析床层的反压，当面对这类大分子、高粘度的料液时，无疑是雪上加霜的。

1991年，Regnier等[1]在Nature上首次提出超大孔灌注色谱填料的概念。这种填料既具有6000~8000Å的贯穿孔（through pores），又具有800~1500Å的扩散孔（diffusion pores）。这种特殊的孔径分布，不同于传统的层析填料，通常需要根据纯化目标进行专门定制。

在分离应用时，这些超大孔微球中的贯穿孔内的流动相以对流形式流动，传质速度快，被分离物质可以迅速接近载体上的结合位点；而扩散孔则可以提供足够高的比表面积，保证了填料的吸附容量。因此，具有这两点优良特性的特殊填料被认为是理想的生物大分子分离填料。

定制化大孔填料在相对传统填料生物大分子纯化中有以下优势：

1、载量高

生物大分子如乙肝抗原、类病毒等在经过层析填料纯化时，孔径是限制这些大分子进孔吸附的关键因素，增大孔径有助于增大大分子在填料上的载量。如下图所示：琼脂糖DEAE填料对小分子BSA静态吸附载量达到几十毫克，小分子BSA在填料表面和内部均可观察到；同样的填料对大分子HBsAg静态吸附载量只有不到1毫克，大分子HBsAg只能吸附在填料表面，无法进入内部孔道构；而对定制化大孔DEAE，大分子HBsAg可以进入其内部孔道，定制化大孔DEAE填料对于大分子HBsAg的吸附载量几乎是琼脂糖DEAE填料的20倍。

2、流速快

由于传统的填料固定相内部只有狭窄的扩散孔，因而其内部传质阻力较大，层析柱压降较大，对于生物大分子的传质速率、分离效率和结构保持都比较低：而定制化大孔填料中对流孔的存在可有效地克服传统填料的上述缺点，孔内对流传质大幅削弱了扩散传质速度慢的影响。

3、有利于保持蛋白活性

IgM分子、蛋白三聚体、新型VLP疫苗和各种基因病毒载体这些生物大分子的分子量大，分子尺寸能达到纳米级，而常规多孔微球填料的孔道较小，生物大分子进出填料的阻力增大、分离时间增长，致使层析柱的分离性能明显降低。同时，会使生物大分子的三级、四级结构变化，造成蛋白质药物质量和收率的下降。在定制化大孔内由于流动相流速快，分离速度快，使生物大分子与介质界面的相互作用时间大幅度减少，同时暴露在不稳定环境中的时间短，可大幅度减少蛋白质的失活，有效提高生物大分子的活性回收率和产率。

定制化大孔填料在生物大分子纯化中的应用优势

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