CGT持续火热，重新定义中的慢病毒生产工艺

Eilot 2022-09-16

最近一年来，细胞治疗产品迎来突破式发展，百时美施贵宝的和传奇生物的CAR-T产品先后获得FDA批准，将CAR-T药物的研发靶点从此前的CD19扩增到BCMA以外，也将细胞治疗产品应用扩展到多发性骨髓瘤领域。

以此同时，随着复星凯特的阿基伦赛注射液（奕凯达）和药明巨诺的瑞基奥伦赛注射液（倍诺达）两款CAR-T产品在中国成功上市， 2021年也被称为中国细胞治疗商业化元年，同时多个产品进入后期阶段或递交上市申请。

从全球看，细胞治疗产品将逐步从临床验证转向深度应用 。截至2022年5月初，ClinicalTrials数据显示全球有8301项细胞治疗研究正在进行中。Evaluate Pharma数据预测，全球细胞及基因治疗的市场规模将从 2017 年的13亿美元增长至2024年的437亿美元，年复合增长率达到 65%。

慢病毒载体基于高效率的转导能力，被广泛应用于CAR-T药物的基因修饰，占比达到60%以上 ，目前包括Kymriah、Breyanzi 和Abecma等上市CAR-T药物均使用慢病毒载体进行生产，不完全统计其成本占到整个细胞产品的30%左右。此外， 慢病毒在基因治疗领域的应用也在不断发展 ，Skysona 、Libmedly和 Zynteglo已在欧洲市场上被批准用于相关罕见病的治疗，并在FDA获得突破性疗法的认证。

慢病毒载体源自如HIV-1的逆转录病毒科病毒，利用逆转录病毒可以将其遗传物质整合到宿主细胞基因组中的天然能力，将慢病毒载体应用到体内外的基因修饰中。慢病毒载体作为100 nm左右的包膜病毒，最多可携带10 kb 的目的基因。 ·

为了限制产生复制型慢病毒 (replication-competent lentivirus，RCL) 的风险，目前第三代慢病毒载体基因组被单独加载到了四个单独的质粒：

编码病毒基本结构的质粒：

gap基因：编码病毒所需的核心结构蛋白

pol基因：编码病毒复制所需要的酶；
VSV-G质粒：编码病毒的包膜糖蛋白，并且可以决定病毒感染宿主的靶向性，目前最常用的为VSV-G蛋白
调节质粒：rev基因编码的蛋白调节gag、pol、CSV-G的表达水平；
携带目的基因的质粒

尽管目前临床的体内外应用中仅需要相对较少量的慢病毒载体，但相关药物价格仍然极为昂贵，例如Kymriah相关的T细胞疗法约为30~50万美元，Zynteglo 更是高达180 万美元。 当前慢病毒商业化的生产工艺还不够完善，这也是药物价格居高不下的主要原因 。同时随着更多产品推进到肿瘤领域基于剂量更高的因素，同时考虑相关潜在适应症的对病毒需求，未来慢病毒总需求量约为5×10¹³ TU/年，产能和成本的问题将更为突出。 下一代细胞基因疗法为提高临床可及率，将重点优化产品生产工艺 。

慢病毒载体的生产工艺包括上游细胞培养、收获澄清、下游纯化和灌装四个环节 ，上游一般使用如HEK293T的永生化细胞系或连续细胞系，在2D容器内进行贴壁培养，或大型生物反应内进行悬浮培养，病毒的滴度和质量基于生产工艺的不同而有所差异，但工艺的可放大性和稳定性仍然是关注的重点。

基于目前大部分慢病毒载体均是采用瞬时转染工艺，因此收获产物中的质粒DNA去除对下游工艺来说是一个不小的挑战，幸运的是，市场上有很好的用于去除残留DNA 的核酸内切酶选择，同时如中空纤维一类的传统换液装置也可进行应用。

下游纯化的主要核心是捕获产品，同时在精纯过程中去除产品相关杂质和工艺相关杂质，通过单元化的操作以提高产品的质量和安全性。从目前公布的相关工艺来看，切向流过滤、阴离子交换层析和密度梯度离心等相关工艺均在慢病毒纯化工艺中有所应用，但是都有不少的限制，工艺步骤多，整体收率仅约30%。

亲和填料基于可放大性和高回收率，在抗体类等其他大分子药物中均有所运用 。此前肝素类的亲和填料对VSV-G具有非特异性亲和力，可有效去除蛋白杂质和残留DNA，含有动物来源的肝素组分有污染风险，不适合GMP工业生产。 2022年赛默飞全新推出CaptureSelect Lenti VSVG慢病毒亲和填料，基于VSVG的特异性亲和层析，专为高效纯化慢病毒载体而设计，一步实现高回收率和纯度，从而重新定义慢病毒的生产工艺。根据相关资料显示，CaptureSelect Lenti VSVG具有以下特性：

填料基架：环氧化物活化的琼脂糖
平均粒径：65 ± 10 µm
配基：CaptureSelect Lenti VSVG亲和配基，特异性结合VSV-G包膜蛋白
高结合载量： ~1E11 总病毒颗粒/ml填料
高回收率： 有感染活性的病毒收率达50-60%
温和洗脱： 精氨酸中性条件洗脱 ，保持病毒高感染性
非动物性来源

根据相关数据显示，将HEK293 细胞生产的慢病毒载体加载到 1 ml (0.66x3 cm) CaptureSelect Lenti VSVG 层析柱上，在 50 mM HEPES 150 mM NaCl pH 7.5 条件中平衡。通过 p24 ELISA 方法检测慢病毒载体滴度，上样前为 3.89x10⁹ TP/ml，进样24.6 ml后有10% 的慢病毒颗粒穿透， 填料的动态结合载量高达1x10¹¹ TP/ml，充分满足商业化生产的需求 。

Lenti VSVG亲和纯化后，有感染力的病毒颗粒收率达50-60%， HCP去除能力达到97%以上。样品1上样前样品中有感染活力的病毒为1.99E10, 洗脱液有感染活力的病毒为9.95E9，回收率达49.9%；样品2，上样前样品中有感染活力的病毒为2.07E10, 洗脱液有感染活力的病毒为1.19E10，回收率达57.7%。

慢病毒载体在基因修饰 T 细胞疗法的开发中发挥了重要作用，随着TCR-T和CAR-NK等其它新型细胞疗法的快速发展，慢病毒载体将不断在其结构元件优化的同时，生产工艺也将在迎来更多的突破，更多如CaptureSelect Lenti VSVG慢病毒亲和填料相关产品的诞生，将不断定义慢病毒的生产工艺，使其在成本、可放大性、稳定性、灵活性和合规性等方面全面提升，建立高效稳定的商业化工艺。

参考文献：

1.Lentiviral Vectors for T Cell Engineering: Clinical Applications, Bioprocessing and Future Perspectives. Viruses 2021 (13): 1528.

2.Manufacturing of viral vectors: part II. Downstream processing and safety aspects. Pharmaceutical Bioprocessing, 2014, 2(3):237-251.