生物反应器规模放大的基本原理

2022-09-02

生物反应器放大的目的是增加产量，同时保持相似的产品质量。这意味着必须跨规模保持相当的细胞特异性生产力、细胞密度和活性以及细胞代谢。为了实现这一点，尽可能多的操作参数必须保持不变。

在工艺放大过程中，温度、pH、溶氧设定点和补液策略等与规模无关的变量很容易保持不变（表1）。然而，与规模相关的参数，如搅拌、叶轮叶尖速度、混合时间、雷诺数和通气流速，在整个放大过程中不能同时保持不变。这是因为它们对搅拌速度、叶轮直径和容器直径具有不同的依赖性。最终，这些参数会影响运营成本、培养异质性、气体转移特性以及施加于细胞的剪切应力。从本质上讲，生物反应器的放大涉及多方面的权衡和妥协。

表1 规模无关变量和规模依赖性变量

虽然搅拌罐生物反应器的体积功率输入通常保持在 10-80 W/m3 的范围内，但其它因素，即混合速度、混合时间、叶轮叶尖速度和雷诺数，根据生产规模的不同而有不同的值。如（表2）所示，搅拌速度随着规模的增加而降低。然而，由于叶轮尺寸增加，叶轮叶尖速度和雷诺数遵循相反的趋势。最后，由于容器直径的增加，混合时间也随着规模的增加而增加。

表2 不同生产规模下规模相关参数的典型值

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几何相似性

几何相似性通常是用于放大生物反应器的第一个标准。如果罐直径增加，所有其它长度（罐高度、叶轮直径和叶轮宽度）都会增加相同的比例因子。一般来说，用于细胞培养的生物反应器罐的高径比 (H/D) 对于台式生物反应器为 1-2，对于中试和工业规模的生物反应器为 2-3。然而，保持 H/D 会影响与表面和体积相关的因素，例如热传递、气体传递和混合。由于在罐壁上发生热交换，每单位体积的热传递随着体积的增加而减少。恒定的 H/D 纵横比也将显著降低表面积与体积比 (Ac/V)，从而降低表面通气对O2和CO2汽提的贡献。因为气体传输速率的重要性以及对混合速度和气体流速的限制，这对于剪切敏感细胞至关重要。

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动力学相似性和规模放大标准

当所有相关力的比率在不同规模上保持不变时，就会存在动态相似性，从而导致，例如，相似的流场。在放大过程中，必须根据对细胞培养性能影响最大的因素来选择标准。由于相互依赖性，当一个关键参数保持不变时，其它因素可能会随着体积的增加而出现显著变化，这可能会导致在较小规模下没有遇到的问题。对于搅拌罐采用的一些最常见的放大标准，可以在（表3）中看到关键的相互依赖的变量。例如，在放大过程中保持恒定的体积功率输入将转化为最大剪切速率的增加（从更大的尖端速度）和搅拌速度的降低。反过来，降低的搅拌速度将导致混合时间增加，可能导致不希望出现的环境异质性。在放大过程中恒定的叶轮叶尖速度或恒定的雷诺数（即类似的流体动力学状态）也意味着混合速度降低。

表3 当容器直径增加5倍时几何相似生物反应器放大参数的相互依赖关系。每列中的1表示在大规模条件下保存。

在剪切敏感细胞的情况下，可以使用恒定的叶轮叶尖速度；然而，体积功率的降低必须通过更高的气体流速来补偿，以保持可接受的氧气传输率，这也可能导致细胞损伤。此外，保持恒定叶轮叶尖速度所需的较低混合速度将导致大规模条件下混合较差。因此，叶轮叶尖速度可能不是生产体积差异较大时的合适放大标准。放大期间恒定的混合时间将导致叶轮叶尖速度增加，这可能导致细胞损坏，以及功率的极大增加。氧气传输、混合和适当的 CO2 汽提通常被认为是生物反应器放大过程中最重要的因素。因此，对于 CHO 细胞生物反应器培养的放大，最常选择对气体传输和混合的影响最小化的标准。

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CHO细胞培养的常见规模放大策略

在本节中，将介绍用于在生物反应器中放大 CHO 细胞培养的最常见策略，并讨论它们的含义。（表4）概述了最近评估不同规模的细胞培养性能的研究，以及所采用的规模缩放标准。

表4 CHO细胞培养规模放大标准示例

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恒定体积功率输入

使用恒定的每液体体积叶轮功率输入 (P/V) 是搅拌和通气容器最常用的规模放大标准之一，其中来自叶轮的机械功率会影响气体传输特性和培养混合。P/V 比可以通过调整叶轮类型、尺寸和速度来适应不同的工作体积。如表 7 所示，此放大标准可以单独使用，也可以与其它因素（例如每单位体积液体的恒定体积气体流量或 vvm）结合使用。恒定 P/V 已用于成功地从 Ambr® 250 小型生物反应器系统转移到 200 L 中试规模的一次性生物反应器，以证明基于空气喷射的 pH 控制策略的有效性。在比较 500 L 中试规模与 3 L 台式生物反应器、或从 Ambr® 250 放大到 3 L 台式然后 50 L 中试规模容器时，应用相同的标准会产生可比的增长、生产力和产品质量属性。恒定 P/V 也被证明是成功的规模缩小标准，以在 Ambr®250 中匹配 18,000 L 工业规模生物反应器的条件和性能。在 200 L 和 2,000 L 规模下，使用恒定 P/V 的细胞培养性能也有可比性，尽管在较大的生物反应器中发现 pCO2 水平更高。

然而，使用恒定的 P/V 可能会转化为小规模和大规模 kLa 值之间的显著差异。为了补偿单位体积氧传质系数的变化，可能需要调整通气策略，以维持所需的溶氧水平。当使用微型生物反应器完成上游工艺开发步骤时尤其如此。然而，所需的流速调整可能会对培养性能产生不利影响，例如 Tescione 等人的研究。当使用 P/V 作为唯一标准从 2,000 L 工业规模容器缩小到 3 L 实验室规模生物反应器时，观察到活细胞密度和最终产品滴度显著降低。在小型生物反应器中，标准化气体体积流量 (vvm) 高出三倍，导致气泡相关的细胞损伤增加。

通过转录组分析比较和评估了使用恒定叶轮叶尖速度或恒定 P/V 从微型 (Ambr®15) 到10 L 生物反应器的规模放大，以评估对基因表达的影响。对于所使用的两种放大标准，获得了可比较的细胞生长和特异性生产率，但与 10 L 生物反应器相比，Ambr®15 中观察到整个培养过程中的 pCO2 水平降低，这是因为微型生物反应器中需要更大的氧气流速，导致CO2 汽提增加。转录组分析显示，随着时间的推移，两种规模之间基因表达的差异很小（低于 6%）。尽管 2455 和 1601 个基因分别在 Ambr®15 和 10 L 生物反应器中受到独特调控，但规模或细胞行为没有进行功能关联。

恒定氧传质系数 (KLa)

在 CHO 细胞培养中，保持适当的氧气传输至关重要，尤其是当生物反应器在高细胞密度下运行时。因此，在规模放大/缩小期间保持恒定 kLa 也是工艺开发中的常用策略。在将 Ambr®250 用作 5 L 实验室规模和 250 L SUB 系统的规模缩小模型时，其已被成功地用作标准。2-3 h-1的 kLa 满足规模缩小模型中的氧气需求，并导致 13 种 GS-CHO 和 DG44-CHO 细胞系中的 11 种具有可比的生长、生产力和最终产物滴度。通过气体流速和搅拌速度调整保持恒定的kLa (7.9 h-1) 也被证明可以在 50 L 到 2,000 L 的一次性生物反应器中产生类似的生长曲线。然而，生产规模的变化可能需要使用不同类型的气体鼓泡，从而使类似工艺条件的实现更加复杂。为了从配备钻孔鼓泡的 2,000 L 容器缩小到使用恒定 kLa 的 3 L 生物反应器，Tescione 等人不得不采用小规模的熔块鼓泡，以避免混合速度过快或气体流速过高，这已被证明对培养性能有害。但与大规模工艺相比，改变鼓泡类型会导致不同的细胞生长和代谢。

为了获得适当的氧气传输，He 等人开发了一个数学传质模型来描述生物反应器内的气体交换。涉及细胞呼吸速率 (qO2, qCO2) 和传质特性 (kLaO2, kLaCO2)的质量平衡方程用于计算满足氧气需求和预测 pCO2 水平所需的气体流速。这种放大方法导致在 2 L 和 1,500 L 条件下获得了相当的活细胞密度和抗体产量。类似地，通过假设与在 2,000 L 生物反应器中测量的结果相同的需氧量，来确定 3 L 缩小模型中所需的 kLa 和富氧水平。这允许设置适当的通气率，从而产生可比的细胞培养性能，而不影响蛋白质质量。

每体积的恒定体积气体流速 (vvm)

溶解的 CO2 积累是生物反应器中 CHO 细胞培养规模放大过程中的一个主要问题，恒定的 vvm 通常用作放大标准，以确保充分的CO2汽提，同时调整搅拌速度，以提供适当的氧合。微型生物反应器 Ambr®15 用于开发工业和台式生物反应器的规模缩小模型，使用总喷射气体流速作为主要规模缩小参数（vvm 为 0.01-0.02）。这种规模缩小的方法允许进行充分的汽提，并使CO2释放曲线在不同规模上保持恒定。由 DoE 确定的最佳操作条件（生长温度、生产温度和 pH 值）表明对于 Ambr®15 和5 L 生物反应器是一致的。另一项研究尝试使用恒定 vvm，针对 500 L 和 2,000 L SUB，使用 Ambr®250 平台生成具有代表性的规模缩小模型。但由于表面气体转移通常占小规模CO2 汽提的很大一部分，因此在小型生物反应器系统中需要较低的归一化通气率来匹配不同规模之间的 pCO2 气体释放曲线。在 pCO2 已被确定为对培养性能有重大影响的不同过程中，恒定 vvm 被用作标准，以匹配工业规模工艺和 Ambr®250 系统之间的溶解气体分布。这种方法导致了不同规模之间可比的活细胞密度和产品滴度，说明需根据工艺的具体要求选择放大程序。

恒定最小通气 vvm 和等效 P/V 已被组合用作规模放大标准，以确保细胞生长、气体传输和 mAb 生产率在 3 L、500 L 和 2,000 L SUB 的各种规模上均匹配。选择最小空气流速以实现适当的 CO2汽提。在另一项研究中，使用恒定 P/V 和 vvm 作为使用 Ambr®250 创建规模缩小模型的标准导致 DO 水平较低 (<5%)，并且无法模拟大规模的性能。这归因于小规模的较低气体停留时间和随之而来的氧气传递系数的降低。在生物反应器放大过程中要考虑的另一个重要因素是气体入口速度的影响。这在工业规模的生物反应器中尤其值得关注，其需要更高的气体流速来供应氧气并确保适当的CO2汽提。高气体入口速度 (>60 m/s) 被认为对培养性能有害，因为在鼓泡区域中湍流能量转移急剧增加。此外，高喷射率已被证明会引发氧化应激反应，并且还与氨基酸消耗的增加有关，以恢复氧化还原平衡。入口速度小于 20 m/s，在某些情况下高达 50 m/s，在小型到大型生物反应器中不会造成明显的细胞损伤。

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恒定叶轮叶尖速度

保持等效的叶轮叶尖速度可被用作规模放大标准，以便在不同的生产规模下保持相当的最大剪切应力水平。例如，当使用 0.7–0.8 m/s 范围内的叶尖速度时，使用这种放大方法导致 Ambr® 生物反应器系统和台式生物反应器之间的活细胞密度和最终产品滴度相似。研究认为叶轮叶尖速度大于 1.5 m/s 会导致细胞损坏。虽然使用恒定的叶轮叶尖速度从 Ambr®15 放大到 2 L 台式生物反应器可以实现相当的生长和生产力，但 2 L 容器中的溶氧水平降低了。对于生产体积的较大变化，使用恒定的叶轮叶尖速度可能会导致氧气传质速率不足和混合不良，因为单位体积功率输入会显著降低（参见表3）。

本文为以下文献内容简介，详细内容，请参考原文。

原文： L.Lemire, P.L.Pham, Y.Durocher, et al., Practical Considerations for the Scale-Up of Chinese Hamster Ovary (CHO) Cell Cultures. Cell Culture Engineering and Technology, 2021.

本文来源于“生物工艺与技术”平台

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