1 绪论
1.1 感冒灵颗粒及其处方
感冒灵颗粒具有解热镇痛的作用,临床用于治疗感冒引起的头痛、发热、鼻塞、流涕、咽痛等。其处方主要包括三叉苦491 g、金盏银盘327 g、野菊花246 g、岗梅736 g、咖啡因0.4 g、对乙酰氨基酚20 g、马来酸氯苯那敏0.4 g、薄荷素油0.2 ml[1]。
1.2 研究目的及方法
目前关于感冒灵颗粒水提和醇沉过程的研究已经很全面,但大多仅限于理论研究。在实际生产中,药厂需要严格遵守药典和药品标准,有些参数都有明确的标准规定,本文基于此基础,采用单因素实验对感冒灵颗粒生产的水提和醇沉工艺进行了优选。
实验通过固定煎煮次数和煎煮时间,从三种加水量组合中选出了理想的组合;通过固定初始乙醇浓度、终点乙醇含量和醇沉时间,从三种初膏密度中选出理想初膏密度,从而优化了水提和醇沉工艺,为生产提供了实验依据。
2 感冒灵水提工艺研究
2.1 实验设备及材料
仪器:Waters e2695-2489UV高效液相色谱仪、色谱柱ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)、TDZ5-WS低速自动平衡离心机、FK224分析天平(d=0.0001 g)、0.45 μm水系微孔滤膜等。
试剂:蒙花苷对照品溶液(由仲景宛西制药有限公司质控部提供)、乙腈、超纯水。
药材:三叉苦(产自安徽亳州)、金盏银盘(产自安徽亳州)、野菊花(产自湖北孝感)、岗梅(产自广东肇庆)。实验所需药材均由仲景宛西制药有限公司提供,经公司质控部鉴别,了解所用三叉苦为芸香科植物三叉苦的根及茎,金盏银盘为菊科植物金盏银盘的干燥全草,野菊花为菊科植物野菊的干燥头状花序,岗梅为冬青科植物梅叶冬青的根及茎,药材中的蒙花苷含量为13.79 mg/g。
2.2 蒙花苷含量测定方法及方法学考察[2]
2.2.1 感冒灵水提液的制备
按处方量的1/10(即180 g)分别称取4种药材,加水煎煮2次,分别加8倍、7倍量水,每次煎煮2 h,过滤,合并滤液,即得感冒灵水提液。
2.2.2 对照品及供试品溶液的制备
对照品溶液的制备: 精密称取蒙花苷对照品3.5 mg置于25 ml容量瓶中,加入甲醇溶解并定容,摇匀,即得对照品溶液。
供试品溶液的制备: 取上述感冒灵水提液80 ml置于离心管内,在5000 r下离心10 min后即得供试品溶液(本实验供试品溶液由仲景宛西制药有限公司质控部提供,已知浓度为0.1419 mg/ml)。
测定方法: 将蒙花苷对照品和供试品溶液按照顺序置于高效液相色谱仪,记录编号,设置进样量为10 μl,照高效液相色谱法进行测定,按外标法进行计算,即得蒙花苷含量。
2.2.3 色谱条件
流动相为乙腈-水(21∶79),检测波长为334 nm,柱温为30℃,流速为1.0 ml·min-1,进样量为10 μl[3]。蒙花苷对照品和供试品溶液的HPLC图谱,如图1和图2所示。
图1 蒙花苷对照品HPLC图谱
图2 供试品HPLC图谱
2.2.4 线性关系考察
精密吸取对照品溶液1 μl、5 μl、8 μl、10 μl、15 μl、20 μl,然后进样,测定峰面积。横坐标、纵坐标分别为对照品进样量(X,μg)和峰面积(Y),可得回归方程Y=899164X-9973.8,R2=0.9993,如图3所示。结果表明,线性关系良好。
图3 线性关系图
2.2.5 精密度试验
设置连续进样6次,进样量为5 μl,记录峰面积,如表1所示。可计算出蒙花苷峰面积RSD(相对标准偏差)值为0.73%。表明在该色谱条件下,该测定方法精密度良好。
2.2.6 稳定性试验
取供试品溶液,分别在制备后的0、2 h、4 h、6 h、8 h进样,进样量为10 μl,得蒙花苷峰面积,如表2所示,计算RSD值为1.51%。表明供试品溶液在室温下放置8 h仍能保持稳定。
2.2.7 重复性试验
取感冒灵水提液,平行制备6份供试品溶液,进样量为10 μl,记录峰面积,如表3所示,计算RSD值为0.61%。表明在该色谱条件下,该定量方法的重复性良好。
2.3 水提工艺研究理论基础
2.3.1 计算公式
2.3.2 单因素实验
本实验单因素的变量为加水量,每次实验保持煎煮2次和煎煮2 h的条件固定不变,以蒙花苷提取率为指标研究水提工艺。根据大生产数据,目前加水量共有3种组合:10倍水+8倍水、8倍水+7倍水、5倍水+3倍水。本实验会通过测定3种加水量的水提液样品峰面积,计算出蒙花苷含量和提取率,从而优选出理想加水量组合。
2.4 实验方法
2.4.1 感冒灵水提液供试品的制备
按处方量的1/10(共180 g)称取3份感冒灵颗粒药材,均加水煎煮2次,每次煎煮2 h。一份加10倍水+8倍水、一份加8倍水+7倍水、一份加5倍水+3倍水。需要注意的是,由于药材具有吸水性,因此每煎1 h 后需要补充水量至初始水平。煎煮2次后,合并煎液,过滤,得水提液,测量滤液体积并记录。取80 ml水提液置于离心管内(平衡放置,装量差异小于0.5 g),将离心机程序设置为“5000 r,10 min”,进行离心,取上清液,编号,即得供试品溶液。
2.4.2 蒙花苷含量的测定
分别吸取3种供试品溶液,经0.45 μm水系微孔滤膜滤过,注入样品瓶中,每瓶收集约1.5 ml滤液,加盖,贴好标签,进行测定。
2.5 实验结果
测定结果如表4所示。已知蒙花苷对照品溶液浓度为0.1419 mg/ml,由2.2.4中所得回归方程,可知在进样量为10 μl时对照品的峰面积约为1 265 940,根据公式2-1,可求得各供试品溶液(亦即水提液)的浓度,由此可得到水提液中蒙花苷的含量;再根据公式2-2,计算可求得蒙花苷提取率,计算结果如图4所示。
图4 蒙花苷提取率
由图4可知,在一定条件下以蒙花苷提取率为指标,提取效果按加水量可排序为: 8倍水+7倍水> 10倍水+8倍水> 5倍水+3倍水。
3 感冒灵醇沉工艺研究
3.2 醇沉工艺理论基础
3.2.1 单因素试验
本实验单因素变量为初膏密度,评价指标为蒙花苷保留率和干浸膏得率,每次实验保持初始乙醇浓度为95%,终点乙醇含量为63%,醇沉时间为48 h的条件固定不变。根据大生产数据,目前常用的初膏相对密度有1.05、1.10、1.15这3种,测定各初膏密度下的峰面积,计算蒙花苷含量;再根据初膏质量和醇沉上清液体积计算出干浸膏得率,综合两方面因素优选出理想初膏密度,计算相关公式如3-1、3-2、3-3、3-4所示。
3.3 实验方法
3.3.1 感冒灵水提液的制备
按处方量称取药材1800 g,加水煎煮2次,分别加8倍、7倍量水,每次煎煮2 h,之后合并煎液,用200目滤网过滤,即得实验用感冒灵水提液。
3.3.2 浓缩液的制备和处理
将上述水提液分成3份,每份体积为7000 ml,在电磁炉上以相同功率600 W进行浓缩,期间不断取浓缩液置于100 ml量筒中,当用温度计测量浓缩液温度为75℃时,用比重计测比重(即相对密度),至比重分别为1.05,1.10,1.15时,停止浓缩,将得到的3种初膏置于烧杯中贴上标签,并记录下体积。每份初膏精密称取1 g,置具塞锥形瓶中,再精密加入甲醇25 ml,密塞,称定重量;用恒温水浴锅对其进行加热,设置温度为65℃;加热回流2 h后,放冷,再称定重量,用甲醇补足缺失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得初膏的供试液[3]。
3.3.3 醇沉上清液的制备
在上述得到的3种不同的初膏中分别均匀缓缓加入95%乙醇,使药液终点乙醇含量为63%,边加边搅拌,至终点时继续搅拌5 min,用保鲜膜盖住烧杯口并密封,然后在2℃的冰箱里冷藏放置48 h后,倒出上清液,测量其体积,并记录[3]。
3.3.4 蒙花苷含量的测定
用注射器分别吸取上述6种样品溶液,按照2.4.2中的步骤进行测量。
3.3.5 干浸膏的处理
精密量取上述得到的3种醇沉上清液各25 ml,倒入蒸发皿中,在水浴锅上蒸干后,再于干燥箱中干燥,设置温度为105℃;烘至恒重后,取出冷却,称重,得到的干浸膏质量如表5所示。
3.4 实验结果
测定结果如表6所示。已知蒙花苷对照品溶液浓度为0.1419 mg/ml,对照品的峰面积为1 265 940,根据公式3-1与3-2,由此可得6种样品溶液相应的蒙花苷含量,再根据公式3-3可得蒙花苷保留率,计算结果如图5所示。
图5 蒙花苷保留率
由图5可知,在一定条件范围内以蒙花苷保留率为指标,提取效果按初膏密度可排序为:1.10处>1.15处>1.05处。
由表5、表6的数据,根据公式3-4可得干浸膏得率,计算结果如图6所示。
图6 干浸膏得率
由图6可知,在一定条件范围内的感冒灵醇沉过程中,以干浸膏得率为指标时,提取效果按初膏密度可排序为:1.15处>1.10处>1.05处。
4 讨 论
4.1 水提工艺
溶剂对物料提取效果的影响是通过浓度差来实现的。一般来说,随着溶剂用量的增加,溶剂中有效成分的浓度会变低,溶剂边界层与物料中有效成分的浓度差会增大,扩散驱动力会增强,最终导致提取率的增高;反之,则提取率下降。但是,因为还存在有效成分的溶解平衡问题,提取率不会随着料液比的增加无限提高;另一方面,由于溶剂量的增加,回收成本也会增加[4]。
由图4可知,在煎煮次数和时间不变的前提下,蒙花苷的提取效果按加水量可排序为:8倍水+7倍水>10倍水+8倍水>5倍水+3倍水。由此推断出,当加水量组合为10倍水+8倍水时,蒙花苷在水中的溶解已达饱和。同时由于在醇沉过程中需要回收乙醇,水提过程中得到的溶液量多会造成回收困难,增加回收成本,因此也需要考虑溶液量对成本回收造成的影响。综合表4和图4,最终可优选出在一定确定条件范围内,理想加水量组合为8倍水+7倍水。
4.2 醇沉工艺
由图5可知,在一定条件范围内,以蒙花苷保留率为指标,蒙花苷的提取效果按初膏密度可排序为:1.10处>1.15处>1.05处。由图6可知,以干浸膏得率为指标时,提取效果按初膏密度可排序为:1.15处>1.10处>1.05处,即干浸膏得率是随着初膏密度的增大而不断提升的。这是因为初膏相对密度越小,膏体含水量就越多,达到同样的终点乙醇含量时所消耗的乙醇体积也越多;而随着乙醇含量的增多,杂质去除的就越多,所以干浸膏的得率就越低。但是醇沉效果并不是越高越好,除杂应适宜,适当地保留一些成分有利于中药疗效的发挥,因此需要控制适量的干浸膏得率。另外也需要从醇沉上清液的体积方面进行考虑,由表6可看出,随着初膏密度的增大,醇沉上清液的体积逐渐减小。
结合蒙花苷保留率、醇沉上清液体积及干浸膏得率进行综合考虑,可得出在一定条件范围内,醇沉工艺理想的初膏相对密度为1.10。
5 结 论
根据本实验数据和分析,可得出结论:感冒灵颗粒水提工艺在煎煮2次、每次煎煮2 h的条件下,理想加水量是一煎加8倍水,二煎加7倍水;醇沉工艺在初始乙醇浓度为95%、终点乙醇含量为63%、醇沉48小时的条件下,理想的初膏密度为1.10。本实验为感冒灵颗粒的水提和醇沉工艺提供了实验研究基础,对工业生产具有指导意义。
【参考文献】
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[2] 邓海欣.感冒灵颗粒工艺优化关键技术研究[D].杭州:浙江大学,2015.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版 一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2020,328.
[4] 邓海欣,闫海杰,陈周全,张跃飞,王龙虎.感冒灵水提工艺的正交试验法优选[J].时珍国医国药,2015,26(02):353-355.
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作者:崔芳菲
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