细胞大规模微载体培养的方法和过程

PHT制药业 2022-05-01

微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。微载体培养是目前公认的最有发展前景的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。

细胞微载体培养的原理

蓝晓科技的微载体广泛应用在疫苗、单抗、基因治疗病毒载体等生物制品的大规模生产中，蓝晓科技自主研发的Seplife LX-MC-dex1细胞培养微载体在Vero细胞、CHO细胞、293T细胞及MDCK细胞等已广泛用于生物制品的大规模生产中，细胞可贴附微球 2D 表面生长，1g的Seplife LX-MC-dex1微载体提供 4400 cm2的表面积给细胞贴附。

Seplife LX-MC-dex1技术参数

细胞生长曲线

Vero细胞在两家不同批次微载体的培养基中，24h至96h细胞生长曲线如图1所示。

图1：蓝晓科技细胞培养微载体和进口微载体用于Vero细胞培养生长曲线

细胞生长情况观察

图2：蓝晓科技细胞培养微载体用于Vero细胞培养细胞生长情况观察

Seplife LX-MC-dex1微载体的应用领域非常广泛，基于微载体生产的疫苗除了新冠以外，还包括脊髓灰质炎、风疹、狂犬病、流感、日本脑炎（乙型脑炎）、呼吸道合胞病毒（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。与其他细胞培养工艺相比，微载体培养工艺可以提高产量，降低成本，并减少污染。

细胞微载体使用方法

1.微载体预处理

首先，干燥的微载体在无 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸缓冲液（PBS pH=7.4，每克微载体加50-100ml）中在室温下浸泡膨胀至少 3 小时。然后，弃去上清液，用新配制的无 Ca2+ 、Mg2+ 的PBS（pH=7.4，每克微载体加30-50ml）洗涤微载体数分钟。接着，弃去 PBS，换上新的无 Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS（pH=7.4，每克微载体加 30-50ml）。之后，微载体溶液用高压灭菌法灭菌（115℃，15min，15psi）。微载体Seplife LX-MC-dex1 非常稳定，可以反复（至少5次）长时间（130°C，12h，27psi）进行高压灭菌而不影响其性能。灭菌结束后使用前，加入培养基润洗置换（20-50ml/g），之后加入 10%血清或无血清培养基放置过夜。

2.微载体培养

准备好消化好的细胞，连同之前准备好的微载体一起加入方瓶或反应器中（微载体加量 1-5g/L），在一定条件下开始培养，4 小时后观察细胞贴附情况。如果细胞贴附良好，继续跟踪培养，观察细胞生长情况。

3 微载体培养操作要点

（1）培养初期：

保证培养基与微球体处于稳定的 pH 与温度水平，接种细胞（对数生长期，而非稳定期）至终体积 1/3 的培养液中，以增加细胞与微载体接触的机会。常使用 2-3g/L 的微载体含量，更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液。由于动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率。通常的操作方式是：在贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢，最大速度 75r/min。

（2）贴壁阶段（3-8d）后，缓慢加入培养液至工作体积，并且增加搅拌速度保证完全均质混合。

（3）培养维持期：进行细胞计数（胞核计数）、葡萄糖测定及细胞形态镜检。随着细胞增殖，微球变得越来越重，需增加搅拌速率。经过 3d 左右，培养液开始呈酸性，需换液。具体方法：停止搅拌，让微珠沉淀 5min，弃掉适宜体积的培养液，缓慢加入新鲜培养液（37℃），重新开始搅拌。

（4）收获细胞：首先，排干培养液，至少用缓冲液漂洗 1 遍；然后，加入相应的酶，快速搅拌（75-125r/min）20-30min；最后，解离收集细胞及其产品。

（5）微载体培养的放大：可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大。使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗、干扰素，已被放大至 4000L 以上。

本文来源于苏州蓝晓生物