以菌落总数、大肠菌群为例演示无菌实验流程

1、实验前准备工作：

对实验台、手、检验用具进行消毒（保证无菌环境和无菌实验用品），微生物的理想环境是无菌，但是更应该做好防护，保护自己。防护衣服，口罩手套必须佩带。

对实验的台面进行擦拭消毒，一般用75%乙醇或新洁而灭溶液。

为保持无菌的进行，对手心手腕这些容易残留细菌的部位进行消毒处理。

实验台上面的药品、盛装样品的盒子等实验用工具要进行消毒处理。

1）实验前检查大肠菌群培养基的量、导气管内是否有气泡。

2）开启超净台风机、在无菌、空气缓慢流动状态下工作。

3）进行无菌称样，这一步其实最好是要佩带手套的。

1）已干热灭菌的吸管使用前过火焰灭菌。

2）无菌吸样

3）无菌接种

1）接种针灭菌

2）接菌试管口灭菌

3）取菌

在接种或向培养皿内倒培养基时，试管口或瓶壁外面不要接触皿底，试管或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。

微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多实验要求在无菌的条件下进行，主要原因：

一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。

要求如下：

无菌室使用与管理要求 

1．工作室应矮小、平整，面积小，高2.2―2.3米，内部装修应平整、光滑，无凹凸不平或棱角等，四壁及屋顶应用不透水之材质，便于擦洗及杀菌。

2．室内采光面积大，从室外应能看到室内情况。

3．为保证无菌室的洁净，无菌室周围需设缓冲走廊，走廊旁再设缓冲间，其面积可小于无菌室。

4．无菌室、缓冲走廊及缓冲间均设有日光灯及供消毒空气用紫外灯，杀菌紫外灯离工作台以1米为宜 ，其电源开关均应设在室外。

5．无菌室与缓冲间进出口应设拉门，门与窗平齐，门缝要封紧，两门应错开，以免空气对流造成污染。

 6．无菌室的使用与管理

（1） 无菌室应保持清洁整齐，室内仅存放必须的检验用具如酒精灯、酒精棉、火柴、镊子、接种针、接种环等。不要放与检测无关的物品

（2） 室内检验用具及凳桌等保持固定位置，不随便移动。

（3） 每2―3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液喷雾消毒空气，最后紫外灯杀菌半小时。

（4） 定期检查室内空气无菌状况，细菌数应控制在10个以下，发现不符合要求时，应立即彻底消毒灭菌。无菌室无菌程度的测定方法：取普通肉汤琼脂平板、改良马丁培养基平板各3个（平板直径均9厘米），置无菌室各工作位置上，开盖曝露半小时，然后倒置进行培养，测细菌总数应置37℃温箱培养48小时；测霉菌数则应置27℃温箱培养5天。细菌、霉菌总数均不得超过10个为合格 。

（5） 无菌室杀菌前，应将所有物品置于操作之部位（待检物例外），然后打开紫外灯杀菌30分钟，时间一到，关闭紫外灯待用。

（6） 进入无菌室前，必须于缓冲间更换消毒过的工作服、工作帽及工作鞋。

（7） 操作应严格按照无菌操作规定进行，操作中少说话，不喧哗，以保持环境的无菌状态。

器材及场所的灭菌消毒 

微生物检验用器材及场所必须进行灭菌或消毒处理，不同的对象采用不同的处理方法。

1.高压蒸汽灭菌: 工作服、口罩、稀释液等，置高压杀菌锅内，一般采用121℃灭菌半小时,当然不同的培养基有不同的要求,应分别处理。

2.火焰灭菌：接种针、接种环等可直接火焰灭菌。

3.高温干燥灭菌：各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160℃灭菌2小时。

4. 一般消毒: 无菌室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法进行灭菌，必须用其他方法进行消毒处理，采用2%石炭酸或来苏儿水溶液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒。

5.空气的消毒：开启紫外灯照射30―60分钟 即可。

准备工作 

1.先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30-60分钟。

2.检验用的有关器材， 搬入无菌室前必须分别进会灭菌消毒。

3.操作人员必须将手清洗消毒，穿戴好无菌工作衣、帽和鞋，才能进入无菌室。

4.进入无菌室后再一次消毒手部，然后才进行检验操作。

操作过程注意事项 

1.动作要轻，不能太快，以免搅动空气增加污染；玻璃器皿也应轻取轻放，以免破损污染环境。

2.操作应在近火焰区进行。

3.接种环、接种针等金属器材使用前后均需灼烧，灼烧时先通过内焰，使残物烘干后再灼烧灭菌。

4.使用吸管时，切勿用嘴直接吸、吹吸管，而必须用洗耳球操作。

5.观察平板时不好 开盖，如欲沾取菌落检查时，必需靠近火焰区操作，平皿盖也不能 大开，而是上下盖适当开缝。

6.进行可疑致病菌涂片染色时，应使用夹子夹持玻片，切勿用手 直接拿玻片，以免造成污染，用过的玻片也应置于消毒液中浸泡消毒，然后再洗涤。

7.工作结束，收拾好工作台上的样品及器材，最后用消毒液擦拭工作台。

制药厂无菌室管理参考：

▍无菌室应本着人员最少、物品最少、工作时间最短的原则，每3平方米应不多于一个人，三楼百级粉碎间应控制在3人以内；一楼接粉室应控制在2人以内。

▍无菌操作间至少每15分钟应彻底消毒手部一次，要求在酒精中浸泡消毒不得低于30秒钟。

▍无菌室内动作幅度要小，走路慢而稳，不得坐在地上，不得倚靠在墙壁或门上，手不能乱摸东西（包括身体、面部、墙体地面等），当不可避免时要及时消毒。

▍操作过程中如果身体出汗较多应当及时更换无菌服和手套。

▍消毒液的配制方法浓度一定要准确，消毒手部时每盆可用10人次，操作间内每小时应当更换一次消手液。消毒房间时要根据消毒面积更换消毒液。

▍无菌衣、鞋的穿戴过程、方式及进出无菌室的流程要严格的培训执行，脱无菌衣要到脱内衣的房间放入脏衣容器内。

▍清场时要注意先上后下，先物后地，先内后外，之字型或单向擦拭，及时更换消毒液。

▍无菌室生产结束后每日应用臭氧消毒2小时。

▍洁净室的门、传递橱门、烘箱门不得同时对开，开关门动作要轻。

▍不得化妆，严禁带饰物和手表进入洁净区。

▍生产中出现异常或偏差（设备故障）时应马上上报工艺员，得到明确指示后方可继续生产。

▍无菌室内不得大声讲话及不必要的交谈。

▍灭菌或消毒后物品到使用的存放时限：消毒液24小时；无菌衣 24小时；瓶盘等直接接触药品的容、器具、管道、设备等  24小时。超过规定时限后应当及时消毒或更换。

▍清洗后物品到灭菌间隔时限：大瓶  72小时（洗后晾干用硫酸纸密封）；盘子及其它物品  24小时。

▍所有物品进入无菌区必须严格消毒或灭菌。

•  物品——消毒——紫外灯照射——消毒——使用      

• 物品——灭菌（双扉）——使用

▍生产过程应有明确的时限：灌装  12小时；喷干  12小时；粉碎 2.5小时；进箱 2小时。超过时限应当停止生产或反馈。

▍无菌室温度应当控制在20-24度以内，粉碎间湿度应在45%以下，关键区域风速应当在0.3米/秒以上 ，压差应当控制在10PA以上，尘埃粒子静态应当符合要求，沉降菌应当动态监测4小时并且每天对手部和无菌服、口罩等进行抽查（生产结束后），表面擦拭应当每天进行作为产品放行的依据。

▍无菌室内直接与产品接触的物体、器具、设备管道等应每批生产结束后进行清洁灭菌，不便于灭菌的应清洁消毒并定期灭菌（至少每周一次）。

▍丝光毛巾应当区分颜色使用，避免混淆。

      绿色：擦拭地面
      黄色：擦拭墙面
      蓝色：擦拭机台、消手
      粉色：擦拭与药液直接接触的物品。

▍AB级间操作时，人体、手部、面部等应当尽量避免直接暴露在产品或关键区域的正上方。

▍在无菌区的工作，必需人员方可进入无菌区；

▍不快速移动，避免不必要的移动；

▍避免从层流区附近走过，至少离开1米；

▍所有掉在地面上的物品均应认为已被污染；

▍接触物品前应对手套消毒；

▍不要触摸口罩，揉鼻子；

▍不要在层流下面的工作台上休息；

▍手臂顺着身体下垂；

▍不要把双手放在臀部；

▍休息时，坐着双手放在膝盖上，不要交叉双手或双脚；

▍必要时才讲话，不要通过气锁讲话；

▍搬运物料时，总是将手放在其底部；

▍搬运物料时总是放在腰部以上位置以减少污染；
▍总是戴上口罩以减少来自口腔的污染；

▍机械和设备的维修保养必须有规律地进行；

▍洁净室和洁净室内物品的清洁是很重要的；

▍操作人员必须始终保持其工作区清洁和整齐。
良好的行为很关键，记住：
穿着正确；
移动正确；
行动正确；
工作正确。
▍不正确的行为

• 不要因为不正确的着装而散播身体的粒子

• 不要因为没有手套的手接触表面和物料而引起交叉污染；

• 不要在洁净室内脱去洁净室工作服；

• 不要用手指擦头发或身体其他部位；

• 不要在患感冒或其他疾病期间进洁净室工作；

• 不要在洁净室吃、喝、抽烟或读报等；

• 不要在洁净室内戴首饰和手表；

• 不要在洁净室使用错误的擦布或清洁物料；

• 不要在洁净室快速地走、移动、转身；

• 不要从前面走进操作者并隔着工作台讲话；

• 不要靠在工作台、产品或其他物料上；

• 不要把手、手臂和手肘放在工作台上休息；

• 不要搬运物料的顶部；

• 不要在工作台上滑动物品。

▍洁净室清洁三原则

• 原则一：总是用灭菌的纯化水或注射用水和新鲜过滤得清洁剂：
  所有过滤的清洁剂必须盛装在清洁并灭过菌的容器中，并正确贴签；
  把预先过滤的清洁剂存放在洁净室中可减小污染的风险。

• 原则二：总是使用清洁的清洁工具和物料以避免将污染物带入洁净室：

不锈钢表面较好，塑料表面易划痕并滞留尘粒和微生物；不要使用带木柄的清洁工具，因其易脱落尘粒；

毛刷易断且滞留微生物，不宜使用；

拖布和抹布应用与洁净室相适应并不易产生脱落纤维的物料制成；

抹布应粘附尘土和细菌，且只使用一次；

洁净室使用的真空吸尘器应安装HEPA过滤器并定期测试。

• 原则三：清洁过程中不得增加洁净室的污染物：
  按照SOP要求，使用正确的清洁工具和物料，避免产生任何污染；
  正确的清洁顺序；

▍洁净室内清洁消毒顺序
天花板、墙壁、与墙壁连接的物体、管道、台面、设备、地面；

从上往下，由里到外清洁；

不要在已清洁过的地面上走动。

▍清洁程序及技术
总是将一定数量的清洁剂加入到水中，不要将水加入到清洁剂中；

总是以重叠的长直线方向擦拭，而不要做转圈的刮擦动作；

总是从最干净的区域向最脏的区域清洁；

总是从按气流方向由过滤器向外、向下清洁；

每擦一次都应将抹布折叠，露出干净的一面；

清洁液应倒在抹布上，而不应到或喷在待清洁的表面；

清洁时应特别注意不要损伤HEPA滤器或其他敏感的设备；

粗的污物通常用装有HEPA的吸尘器从所有区域除去；

然后用粘有适宜清洁剂的湿或潮湿的抹布擦或拖布拖；

只有在已清洁过的表面上才能进行消毒；

清洁控制板及元件时，所有电源均应关闭；

除非特许，清洁液决不允许流入设备；

所有的清洁液在用后须倒掉；

清洁人员的正确行为在洁净室中是至关重要的。