试验用毕赤酵母工程菌编号为Pp-AMP-01，表达载体为pPICZαA-AMP，目标产物为带6×His标签的分泌型抗菌肽。发酵上清取自5L 发酵罐小试批次，批号分别为FS-202501、FS-202502和FS-202503，诱导结束后于4℃保存并在24h内进入预处理。亲和填料采用NiNTAAgarose，填料批号为NTA-240912，装柱体积20 mL，层析柱规格为16mm ×200mm。平衡液为20 mmol/L磷酸盐缓冲液，含0.30mol/LNaCl，pH7.4；洗杂液在平衡液基础上加入20mmol/L咪唑；梯度洗脱液咪唑浓度设置为50、100、150、200、250mmol/L。超滤脱盐材料为3kDa 截留分子量离心超滤管，批号UF-3K-2411。 HPLC 流动相A为0.1% 三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1% 三氟乙酸乙腈溶液；电泳采用16.5%SDS-TricinePAGE胶。耐药指示菌包括MRSA ATCC43300、耐药大肠埃希菌EC-R01和耐药铜绿假单胞菌PA-R02。

设备包括ÄKTAStart层析系统，序列号AKS-230617，配UV280 nm检测模块；BT100-2J 恒流泵，流速范围0.1～100 mL/min；Agilent  1260 Infinity Ⅱ HPLC系统，检测波长214nm，色谱柱C18柱，规格4.6mm×250mm，粒径5μm；Bio-Rad MiniPROTEAN Tetra电泳仪；Thermo Multiskan FC酶标仪，检测波长600nm；Eppendorf 5810R冷冻离心机； Millipore Amicon 超滤浓缩装置。

2.2

发酵上清预处理与亲和纯化方法

发酵液首先在4 ℃、8000 r/min条件下离心15 min，去除菌体和较大颗粒，取上清后依次通过0.45 μm 和0.22 μm 滤膜。过滤后的样品用1mol/LNaOH 或1mol/LHCl 调节pH值至7.4，并补加NaCl 至0.30 mol/L，使其与亲和柱平衡体系一致。

亲和纯化前，用5个柱体积平衡液冲洗层析柱，待UV基线稳定后上样，上样流速控制为1.0 mL/min。上样结束后，用8个柱体积洗杂液去除弱结合宿主蛋白、培养基残留和部分降解片段。随后按50～250 mmol/L 咪唑进行分段梯度洗脱，每一梯度收集2个柱体积洗脱液，收集管编号为E1～E10。各组分经UV吸收、HPLC主峰面积和电泳条带初筛后，合并目标肽富集组分。合并液采用3 kDa超滤管进行脱盐浓缩，离心条件为4℃、4000r/min，每次20min，置换缓冲液为10 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2。最终样品分装后置于-20℃保存，避免反复冻融造成活性衰减。

2.3

评价指标与计算方法

纯化效果以目标肽回收率、纯化倍数、纯度和抗菌活性为主要评价指标。目标肽浓度采用HPLC外标法测定，并结合BCA（二喹啉甲酸）蛋白定量结果进行校正。目标肽回收率计算：

（1）式中，R 为目标肽回收率；C₀为上样液中目目标肽浓浓度；度；V₀ 为上样体积；C₁为洗脱液中目标肽浓度；V₁为洗脱液体积。纯化倍数计算：

 (2)式中，F为纯化倍数；P₀为发酵上清中目标肽纯度；P₁为纯化后目标肽纯度。

纯度采用RP-HPLC峰面积归一化法计算，电泳灰度分析用于辅助判断杂蛋白去除效果。抗菌活性采用微量肉汤稀释法测定MIC和MBC，并以OD₆₀₀ 抑制率比较不同洗脱组分的活性差异。耐药菌操作在二级生物安全实验室内进行，试验设置培养基空白、菌液对照和阳性药物对照，以降低背景吸收、接种量偏差和培养时间差异对结果的影响。

PART.0 3

梯度洗脱亲和纯化工艺优化

目标抗菌肽带有6 × His标签，其在Ni-NTA填料上的结合强度受咪唑浓度、体系pH值、流速和上样量共同影响。咪唑浓度决定目标肽从填料表面的解离程度，浓度不足时目标肽残留在柱内，浓度过高则会使强结合杂蛋白同步释放。pH值会改变抗菌肽及宿主蛋白的电荷状态，进而影响配位结合和非特异吸附。流速关系到样品在填料孔道中的传质时间，过快容易导致峰展宽和分离度下降。上样量则影响柱容量利用率，超过适宜范围后会增加目标肽穿透及杂蛋白夹带风险。结合预试验结果，设置表1所示因素水平。

图1显示，低浓度洗杂阶段UV280吸收值较高，但目标肽HPLC峰面积占比较低，其中20 mmol/L咪唑洗杂组分的UV280吸收值为0.62，目标肽峰面积占比仅为9.4%，说明该阶段主要去除了弱结合宿主蛋白和培养基残留物。50 mmol/L咪唑组分的目标肽占比升至18.6%，仍未形成有效富集。随着咪唑浓度提高至100 mmol/L，目标峰明显增强，HPLC峰面积占比达到54.3%。当咪唑浓度处于150 mmol/L 和200 mmol/L时，目标肽释放较集中，峰面积占比分别为82.7% 和78.4%，UV峰形较对称，峰拖尾现象较轻。继续升至250 mmol/L后，UV280吸收值仍有0.74，但目标肽占比降至61.5%，提示强结合杂质开始进入洗脱组分。由此可见，中等梯度有助于目标肽集中洗脱，而过强洗脱会增加杂蛋白共洗脱及后续脱盐负荷。

为避免只追求纯度而忽略功能损失，研究将纯度、回收率、纯化倍数和活性保持率共同作为筛选依据。活性保持率计算：

(3)式中，A为活性保持率；I₀为纯化前样品单位目标肽抑菌活性；I₁为纯化后样品单位目标肽抑菌活性。由表2可知，S1洗脱强度偏低，目标肽释放不充分，纯度和回收率均处于较低水平。S4回收率达到88.7%，但纯度下降至84.2%，活性保持率降至82.6%，说明高浓度咪唑和较快流速使杂蛋白夹带增加，同时加重了脱盐处理对活性的影响。S3的回收率略高于S2，但峰集中度和活性保持率不及S2，推测与上样量增大后杂蛋白竞争结合有关。综合比较，S2为较优方案，即咪唑浓度150 mmol/L、pH7.4、流速1.0 mL/min、上样量1.5 mg/mL 填料。在该条件下，目标肽纯度为91.8%，回收率为84.6%，纯化倍数为5.6，活性保持率为93.2%，能够在分离选择性、产物回收和功能保持之间取得较好平衡。

不同纯化阶段样品的抑菌差异见图2。发酵上清对MRSA、耐药大肠埃希菌和耐药铜绿假单胞菌的抑制率分别为46.8%、38.5% 和31.6%，单位蛋白活性偏低，主要与杂蛋白和培养基残留稀释目标肽有关。洗杂组分抑制率仅为12.4%～18.7%，说明弱结合杂质并非主要活性来源。目标洗脱组分的抑制率明显升高，对3种耐药菌分别达到88.9%、81.6%和72.4%；经脱盐浓缩后分别保持在86.7%、79.3% 和70.8%，下降幅度较小。图2中，目标洗脱组分和脱盐浓缩产物的活性变化与表3 中的高活性保持率一致，表明抗菌活性主要随目标肽富集而增强。铜绿假单胞菌抑制率低于MRSA，可能与其外膜屏障和外排系统较强有关。