对冻干工艺保护用氮气质量控制方法的建立与应用

石艳红徐海燕曹聪何亮李望华罗敏 2026-07-17

本文旨在建立冻干疫苗保护用氮气的质量控制方法，确保氮气质量满足工艺使用需求。研究方法为：按照 GB/T 8979-2008《纯氮、高纯氮和超纯氮》中高纯氮的要求制定质量标准，并对关键检测项目（纯度检测方法）进行验证。结果表明，通过对氮气的纯度、氧含量、一氧化碳、二氧化碳、氢含量、甲烷及水含量进行质量控制，氮气纯度检测方法的专属性、检测限、定量限、精密度和耐用性验证结果均显示该方法参数满足检测需求。

氮是地球上第 30 丰富的元素。氮气占大气成分的78% 以上，资源丰富且易于获得 ^[1]。工业上常通过分馏液态空气的方法获得大量氮气 ^[2-3]，氮气分子由 2 个 N 原子通过叁键结合而成，包含 1 个 σ 键和 2 个 π 键。因为化学反应中 π 键首先受到攻击，而 N2 分子中 π 键的能级低于 σ 键，打开 π 键较为困难，因此 N2 难以参与化学反应^[4]。氮气在常温常压下是一种无色无味的惰性气体，化学性质高度稳定，工业上常利用其惰性保护的特性 ^[5-6]。通过冷冻干燥法制备的注射用无菌粉末被称为冻干制剂。这类制剂经低温真空干燥后水分含量极低，充入氮气密封后，可实现长期保存 ^[7-9]。充入的氮气会与产品直接接触，因此在生产工艺中需对氮气进行全面的质量控制，确保所充氮气既能有效发挥保护作用，又不会给产品带来风险。因此，武汉生物制品研究所有限责任公司（以下简称公司）将冻干工艺中所用的氮气按原材料进行管理，考虑到氮气的纯度、水含量及其他成分可能对产品造成风险，特按照GB/T 8979-2008《纯氮、高纯氮和超纯氮》中关于高纯氮的要求建立质量标准 ^[10]，如表 1 所示。

表 1 冻干保护用氮气可接收标准

Part1 材料与方法

1.1

标准气体

标准气体的编号为 GBW(E)061527，购自大连大特气体有限公司。

1.2

待检样品

氮气（批号 20230403005）购自武汉市同和气体制造有限公司。

1.3

主要检验仪器

主要检验仪器为 HT-PD300 便携式露点仪、上海华爱 GC-9560 气相色谱仪 ^[11] 。

1.4

水含量检测

将供试品气体与 HT-PD300 便携式露点仪相连，测量体积比浓度两次，取其算术平均值作为结果。水含量应≤ 3×10^-6。

1.5

氮气纯度检测 ^[12-17]

检测采用气相色谱法，依次从色谱条件设定、标准气体校准、供试品检测、数据计算及结果判定五个方面开展，具体操作要求如下。

1.5.1

色谱条件

色谱条件为：载气为氮气；炉温为 75℃ ；检测器温度（FID）为 180℃ ；辅助 1 温度为 360℃ ；氧化锆检测器温度为 700℃ ；色谱柱 1 为 TDX-01，目数为 60-80，柱长为 1 m ；色谱柱 2 为 5A，目数为 40-60，柱长 4 m。

1.5.2

标气检测

标准气体连续进样，直至连续三针样品各组分的峰高相对标准偏差（RSD）均不大于 5%，取三针平均值计算校正因子（各组分浓度 / 峰面积）。

1.5.3

供试品气体检测

通入供试品气体，弃去前 6 针后，再进样 2 针进行检测，计算这 2 针供试品中各杂质气体对应的氮气纯度。

1.5.4

数据计算

使用气相色谱仪后处理软件，以外标法按峰面积计算各供试品气体中杂质气体的含量，并计算氮气纯度：φ=100-（φ1+φ2+φ3 ＋ φ4+φ5+φ6）×10^-4φ。其中，φ 为氮气纯度（体积分数），单位为 % ；φ1 为氧含量（体积分数），单位为 10^-6；φ2 为氢含量（体积分数），单位为 10^-6 ；φ3 为一氧化碳含量（体积分数），单位为10^-6 ；φ4 为二氧化碳含量（体积分数），单位为 10^-6 ；φ5 为甲烷含量（体积分数），单位为 10^-6 ；φ6 为水含量（体积分数），单位为 10^-6。

1.5.5

判定标准

氮气纯度应≥ 99.999% ；氧含量应≤ 3×10^-6 ；氢含量应≤ 1×10^-6 ；一氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；二氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；甲烷含量应≤ 1×10^-6。

1.6

氮气纯度检测方法学验证^[18-19]

气相色谱法用于氮气纯度测定，参照《中国药典》要求执行。验证参数包括专属性、检测限、定量限、精密度（含中间精密度与重复性）及耐用性。

1.6.1

专属性验证

考察各杂质气体峰与相邻峰能否充分分离，以显示对相邻峰及各杂质峰的检测。进样 1 针标准气体，记录H₂、O₂、CO、CH₄、CO₂ 的峰与相邻峰之间的分离度。可接受标准：H₂、O₂、CO、CH₄、CO₂ 的峰与相邻峰之间的分离度应不低于 1.5。

1.6.2

检测限与定量限验证（杂质气体）

考察氮气中各杂质气体的最低检出量及各杂质气体能被定量测定的最低量。进样标准气体 6 针，记录 H₂、O₂、CO、CH₄、CO₂ 的峰高，计算各杂质气体的检测限、定量限以及各组分峰高的 RSD。可接受标准：各组分检测限 D ≤ 0.1 ppm（0.1×10^-6）；H₂、CO、CH₄、CO₂的定量限 L ≤ 1 ppm（1×10^-6），O₂ 定量限 L ≤ 3 ppm（3×10^-6）；各组分峰高的 RSD 应≤ 8%。

1.6.3

精密度（重复性）验证

确认同样操作条件下，较短时间间隔的精密度。实验员 1 取同一批氮气进样 6 次进行检测。计算各供试品中 H₂、O₂、CO、CH₄、CO₂ 的含量及各组分含量的 RSD，同时计算氮气的纯度及纯度的 RSD。重复性可接受标准如下：6 次供试品检测中，氮气纯度应 ≥ 99.999% ；氧含量应 ≤ 3×10^-6 ；氢含量应≤ 1×10^-6 ；一氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；二氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；甲烷含量应≤ 1×10^-6。此外，6 次供试品检测中氮气纯度的 RSD 应≤ 1%，各杂质气体含量的RSD 值≤ 15%。

1.6.4

精密度（中间精密度）验证

本测试旨在验证方法在不同操作者、不同测试日期下的变异情况。实验员 2 在不同时间进样检测 6 次，计算 6 次检测中各供试品的 H₂、O₂、CO、CH₄、CO₂ 的含量及各组分含量的 RSD，同时计算氮气的纯度及纯度的 RSD，并计算通过方法重复性测得的 12 份供试品溶液中各组分含量的 RSD 值，以及氮气纯度的 RSD值。中间精密度可接受标准为：6 次供试品检测中，氮气纯度应 ≥ 99.999% ；氧含量应 ≤ 3×10^-6 ；氢含量应≤ 1×10^-6 ；一氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；二氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；甲烷含量应≤ 1×10^-6。12 次供试品检测中，氮气纯度的 RSD 应≤ 1%，各杂质气体含量的RSD 值应≤ 15%。

1.6.5

耐用性确认

考察检测样品测定过程中检测器温度（180±5℃）、氧化锆检测器温度（700℃ ±10℃）发生微小波动时，检测结果不受影响的能力。耐用性可接受标准为：供试品检测时，氮气纯度应≥ 99.999% ；氧含量应≤ 3×10^-6 ；氢含量应≤ 1×10^-6 ；一氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；二氧化碳含量应≤ 1×10^-6 ；甲烷含量应≤ 1×10^-6。在变换条件和原条件下，共 6 次测定各杂质气体的 RSD 应≤ 15%，氮气纯度的 RSD 应≤ 1%。

Part2 结果

2.1

氮气纯度方法学验证结果

为全面验证氮气纯度检测方法的可靠性与适用性，分别从专属性、检测限与定量限、重复性、中间精密度及耐用性五个核心维度开展验证，各维度具体验证结果如下。

2.1.1

专属性结果

CO、CO₂、H₂、O₂、CH₄ 与相邻峰之间的分离度均不低于 1.5，符合专属性可接受标准，专属性验证结果如表 2 所示。

表 2 专属性验证结果

2.1.2

检测限与定量限

6 针各杂质气体峰高的 RSD ≤ 8%，符合各组分检测限 D ≤ 0.1 ppm（0.1×10^-6）的要求；H₂、CO、CH₄、CO₂ 的定量限 L ≤ 1 ppm（1×10^-6），O₂ 定量限L ≤ 3 ppm（3×10^-6），均符合可接收标准，检测限与定量限验证结果如表 3 所示。

表 3 检测限与定量限验证结果

2.1.3

重复性结果

实验员 1 对同一批样品进行 6 次检测，6 次检测的RSD 为 12%，氮气纯度均为 100.000%。根据标准要求，6 次供试品检测中氮气纯度的 RSD 应≤ 1%，各杂质气体含量 RSD 值应≤ 15%，本次检测结果符合可接收标准，重复性与中间精密度验证结果如表 4 所示。

表 4 重复性与中间精密度验证结果

2.1.4

中间精密度结果

实验员 2 在另一时间进行 6 次进样检测，CO、CO₂、H₂、CH₄ 均未检出，O₂ 含量与实验员 1 重复性项下共 12次检测的 RSD 为 13%，氮气纯度均为 100.000%，符合可接收标准，重复性与中间精密度验证结果如表 4 所示。

2.1.5

耐用性验证结果

将检测器温度调至 175℃时，CO、CO₂、H₂、CH₄均未检出；该条件下 3 次检测结果与 O₂ 含量正常条件下 3 次检测结果合并后，共 6 次结果的 RSD 为 13%，且氮气纯度均为 100.000%。将检测器温度调至 185℃时，CO、CO₂、H₂、CH₄ 均未检出，合并该条件下 3 次检测结果与 O₂ 含量正常条件下 3 次检测结果（共 6 次），RSD 为 8%，氮气纯度均为 100.000% ；将氧化锆温度调至 690℃时，CO、CO₂、H₂、CH₄ 均未检出，合并该条件下 3 次检测结果与 O₂ 含量正常条件下 3 次检测结果（共 6 次），RSD 为 12%，氮气纯度均为 100.000% ；将氧化锆温度调至 710℃时，CO、CO₂、H₂、CH₄ 均未检出，合并该条件下 3 次检测结果与 O₂ 含量正常条件下3 次检测结果（共 6 次），RSD 为 15%，氮气纯度均为100.000%。以上结果符合可接收标准，耐用性验证结果如表 5 所示。

表 5 耐用性验证结果

2.2

适用性检测结果

按照所建立的氮气质量标准对该批氮气进行检测，已完成 3 批氮气检测工作，结果均符合规定要求，检测结果如表 6 所示。

表 6 3 批氮气检测结果

Part3 讨论

依据 GB/T 8979-2008《纯氮、高纯氮和超纯氮》中关于高纯氮的要求建立质量标准，并针对关键检测项目——氮气纯度进行方法学验证。数据结果表明，该方法的专属性、检测限、定量限、精密度及耐用性验证结果均满足检测需求。同时，对公司采购的氮气进行适用性检测，结果显示氮气符合质量标准要求，能够满足生产工艺的质量要求。目前已采用所建立的方法对 3 批高纯氮进行检测，检测结果均符合规定；检测合格的高纯氮已应用于乙型脑炎减毒活疫苗冻干后的充氮保护，且对疫苗起到了有效的保护作用。

用于无菌冻干产品的氮气在充氮过程中会经过滤膜过滤^[20]，且需两次通过 0.22 μm 的除菌过滤，以此控制氮气可能带来的微生物风险。同时，在工艺验证阶段会通过模拟灌装和工艺验证，确保该充氮工艺不会带来微生物风险。药液充氮保护的基本原理是利用惰性气体（通常是氮气）替代空气中的氧气，从而减少氧气对化学品的氧化、分解和腐蚀作用。

药液充氮保护的基本原理包括以下几个方面：

● 氧化反应的阻断：氧气是许多化学反应的氧化剂，可与化学品中的其他物质发生氧化反应。药液充氮保护通过排除氧气，减少了氧气与化学品发生氧化反应的机会，从而延缓或阻止化学品的氧化反应；

● 分解反应的抑制：许多化学品在空气中易发生分解反应，导致其性质改变甚至失去活性。药液充氮保护通过排除空气中的氧气，降低了化学品发生分解反应的可能性，从而保持了化学品的稳定性和活性；

● 腐蚀的减轻：许多化学品具有腐蚀性，它们会与空气中的水分和氧气发生反应，导致容器和管道的腐蚀。药液充氮保护通过排除空气中的水分和氧气，减少了化学品与容器、管道发生腐蚀的可能性，从而延长容器和管道的使用寿命；

● 气氛的稳定性：药液充氮保护还可以提供稳定的气氛，保持化学品容器内压力和温度的稳定。这对一些对温度和压力敏感的化学品非常重要，可防止它们因外界条件变化而发生不可逆反应。因此，对氮气的纯度、氧含量、一氧化碳、二氧化碳、氢含量、甲烷、水含量进行质量控制，可以确保充氮后产品的稳定性。

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责任编辑：邵丽竹

审　　核：何发