非IgG样双抗下游纯化工艺过程

生物制药合伙人 2025-05-28

非IgG样双抗（不含Fc片段）的下游纯化工艺需针对其结构特点（如分子量小、缺乏Fc区）设计特异性方案，主要流程如下。

非IgG样双抗（不含Fc片段）的下游纯化工艺需针对其结构特点（如分子量小、缺乏Fc区）设计特异性方案，主要流程如下：

一、轻链靶向亲和捕获

由于缺乏Fc区，传统蛋白A层析无法适用。

需采用轻链特异性亲和层析：

1.Kappaselect/LambdabFabselect：结合κ或λ轻链恒定区（CL），通过pH梯度（3.0–3.5）洗脱实现高效捕获。

2.Wuxibody平台：通过工程化轻链结合位点，结合Kappaselect层析分离同源二聚体。

二、混合模式层析去除杂质

混合模式层析结合多机制作用，可高效去除宿主细胞蛋白（HCP）、病毒及聚集体：MMC：阳离子交换+疏水作用，动态载量达58–74 mg/ml，去除HCP>60%，聚集体残留<1%。

三、离子交换精纯

根据等电点（PI）差异分离电荷异构体及片段：

1.阳离子交换层析：在pH 5.0–6.0条件下，通过盐梯度（0–250 mM NaCl）去除半抗体及轻链缺失片段。

2.阴离子交换层析：针对PI较低的杂质（如错配同源二聚体），采用流穿模式（pH 8.0–9.0）实现分离。

四、病毒安全与超滤渗滤

非IgG样双抗（不含Fc片段）的下游纯化工艺需针对其结构特点（如分子量小、缺乏Fc区）设计特异性方案，主要流程如下：

一、轻链靶向亲和捕获

由于缺乏Fc区，传统蛋白A层析无法适用。

需采用轻链特异性亲和层析：

1.Kappaselect/LambdabFabselect：结合κ或λ轻链恒定区（CL），通过pH梯度（3.0–3.5）洗脱实现高效捕获。

2.Wuxibody平台：通过工程化轻链结合位点，结合Kappaselect层析分离同源二聚体。

二、混合模式层析去除杂质

三、离子交换精纯

根据等电点（PI）差异分离电荷异构体及片段：

1.阳离子交换层析：在pH 5.0–6.0条件下，通过盐梯度（0–250 mM NaCl）去除半抗体及轻链缺失片段。

2.阴离子交换层析：针对PI较低的杂质（如错配同源二聚体），采用流穿模式（pH 8.0–9.0）实现分离。

四、病毒安全与超滤渗滤

1.低pH病毒灭活：pH≤3.8孵育30分钟，灭活脂包膜病毒（如X-MulV）≥4.6 LRV。

2.病毒过滤：使用Planova 20N（PES膜）截留细小病毒（18–26 nm），截留率>4 LRV。

3.超滤渗滤：通过UF/DF置换缓冲液并浓缩至制剂浓度，同时降低内毒素至<5 EU/mg。

五、关键挑战与解决方案

1.错配产物：通过分子设计（如KiH技术）减少重链/轻链错配，结合离子交换层析分离。

2.聚集体：采用羟基磷灰石层析（如Baroncht Type II）或Capto MMC，聚集体残留可控制在0.5%以下。

3.工艺成本：混合模式层析（如Capto MMC）可替代多步离子交换，降低填料成本30%以上。典型工艺流程示例

轻链亲和捕获（Kappaselect） → 低pH病毒灭活 → 混合模式层析（ MMC Large Scale） → 阳离子交换精纯 → 病毒过滤（Planova 20N） → 超滤渗滤

该流程可实现纯度>98%、回收率>85%。

责任编辑：邵丽竹

审　　核：何发