新技术酶法大规模制造高纯度硫代修饰寡核苷酸分子

2013-08-12

7月4日的《PLoS ONE》最新报道了一种制造硫代修饰寡核苷酸分子的新方法,可用于生产成分高纯度的寡核苷酸类基因药物.

7月4日的《PLoS ONE》最新报道了一种制造硫代修饰寡核苷酸分子的新方法，可用于生产成分高纯度的寡核苷酸类基因药物。这项技术由中国海洋大学生命科学学院的研究人员完成，这一研究成果将有助于推动寡核苷酸药物的发展。

目前，寡核苷酸主要采用化学方法合成，但化学合成寡核苷酸涉及多步骤的反应，容易现错误，产物纯度较低，而纯化十分困难。大规模合成寡核苷酸的成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。文章的通讯作者，中国海洋大学的汪小龙副教授解释道：“我们首创了一种新的基于热循环的寡核苷酸扩增方法，称为 “聚合酶-内切酶扩增反应”(Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR)，该方法采用酶催化法使寡核苷酸分子数目指数增加，实现寡核苷酸的自我复制，大大提高寡核苷酸产品的纯度。”

该论文的另一作者陈刚博士说：“这种新的寡核苷酸生产方法具有很多优点，能解决目前寡核苷酸制造中的诸多问题。PEAR产物无需经过任何处理，无需加入新的引物和模板，直接作为‘种子’进行二次扩增，使寡核苷酸等小分子核酸能够像病毒一样自我复制。相对化学法该技术不需要昂贵的设备，大大降低了生产成本，而且很容易将工艺放大，能够用于大规模生产修饰寡核苷酸。”

PEAR反应独特的“滑动-切割反应机理”，由耐热DNA聚合酶和耐热限制性内切酶协同作用，使得只有目标序列寡核苷酸能够指数扩增，而非目标序列由于缺少重复序列和酶切位点，无法被扩增。目前该研究小组已成功用PEAR方法制备出了带有硫代、氟代和甲基修饰基团的寡核苷酸，经变性高效液相色谱和电喷雾质谱检测(LC/MS)，证实其分子结构和序列无误。与化学合成法相比，PEAR产物几乎没有错误序列，因此PEAR产物纯度极高，产物中目标寡核苷酸序列含量所占比例超过99.9%。

该研究由国家自然科学基金项目“聚合酶-内切酶扩增反应制备反义寡核苷酸(81072567)”资助。该课题评审和立项专家意见认为：“PEAR技术在大规模制备寡核苷酸药物中具有良好的应用前景”。目前该方法已经申请了国际发明专利(PCT/CN2009/000362)。

新技术酶法大规模制造高纯度硫代修饰寡核苷酸分子

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