生物制剂作为治疗药剂使用时，合适的缓释、控释给药方式是其中的一个关键步骤，因此在此方面的研发显得尤为重要。动态激光酶标仪提供了快速、自动化测定蛋白质特性的功能。

2010年度德国药品市场中生物制剂的市场份额占到了大约20%，其中绝大部分是单克隆抗体。而在生物制剂成为治疗药剂的过程中，缓释、控释给药方式的研发是一个非常重要的环节。缓释、控释方式研发的目的，是使蛋白质和蛋白质复合体达到稳定状态——在通过缓释、控释方式研发得到的合适缓冲剂的缓冲下使其高敏感性的3D结构保持稳定。开发出来的缓释、控释方式应能抵抗物理因素和化学因素的影响。蛋白质药剂给药方式中的典型问题是共价的和非共价的聚合物、脱氨、裂解、氧化以及表面变性。在缓释、控释给药方式的研发中，为使生物制剂保持稳定，使用了多种辅助成分，例如糖、盐、抗氧化剂、氨基酸和清浮剂等。由于这些添加剂按照不同的浓度、pH值和缓冲、控释方法组合起来，因此排列组合后的性能试验次数是一个非常庞大的试验序列。

更快速地得到准确结果

在缓释、控释方法研究中，蛋白质特性定性和定量的常规分析方法采用分子排阻色谱法（SEC/GPC）。这种方法常常要采用多角度光散射器尺寸筛析色谱法（MALS），以便能够对提取物中的分子质量进行绝对测量，从而能够对蛋白质的稳定性和试验的结果进行优化。分子排阻色谱法的最大缺点是稀释、剪切和与固相的交互作用而改变了蛋白质的聚合，而且每一次试验检测时，流动相调整平衡所需的时间会使分子排阻色谱法在大规模试验检测中的应用受到限制。

因此，缓释、控释方案的研究常常是围绕着无酸方法展开的，例如不对称场流分离技术（AF4）、场流分级分离(HF5)和动态激光技术（DLS）。与其他方法相比较，动态激光技术具有能够实现自动化检测、检测速度快、只需使用一块微孔板等优点，并有着很高的“生产能力”。另外，被测样本也无需稀释，不受到剪切力的作用，从而有效避免了对检测结果带来的不利影响。利用DLS动态激光检测技术可以测定缓冲、控释方案开发所需的重要参数，例如粘度、聚合特性、溶解性以及解离常数等。

动态激光酶标仪根据由分子布朗运动所引起的散射光强度时间性的波动起伏来进行检验测定（图2）。在溶液中，直径尺寸大的分子比直径尺寸较小的分子运动速度要低。通过对速度波动变化（图3）的检测，可以检测到扩散常数、在斯托克斯—爱因斯坦方程帮助下计算出颗粒的大小。

散射光量的检测是利用雪崩二极管来完成的。这种二极管为动态激光酶标仪提供了很高的时间分辨率（100ns）。在随后的自动相关器中，相关器的微处理器对散射光量的波动情况进行分析。分子越大，也就是说传播运动的速度越慢，则它的信号在相关器中出现的就越晚。

利用由DLS动态激光酶标仪所检测到的数据为扩散系数（DT），可以利用斯托克斯—爱因斯坦方程计算出水力半径（Rh）。所谓的水力半径Rh指的是等于被测蛋白质检测到扩散速度的球半径。因此，水力半径也常常称之为等效球半径。水力半径的识别界限范围在0.3nm~1μm之间，其中下限值是由使用盐进行缓冲而得到的界限值，上限值是由重力产生的。由于散射强度与分子质量成正比，因此这种方法在识别少量大分子时非常灵敏。

满足高浓度制剂检测分析的要求

现代的蛋白质制剂都是高浓缩的制剂，蛋白质的含量可高达200mg/mL。这也对检测分析技术提出了很高的要求，因为浓度的提高使得粘度也大大增高，只有准确地测得蛋白质溶液的粘度，才能准确测定水力半径。而自动化的DLS动态激光酶标仪检测技术就是一种利用“示踪粒子”自动测定蛋白质溶液粘度的检测方法。相关人员证明了利用自动化的DLS动态激光酶标仪还能够测定解离常数kD和第二维里系数A2。利用自动化的动态激光酶标仪测定这些参数的优点，是有着很高的自动化程度、很高的检测速度和很少的被测样本数量。

在上面介绍的检测中，使用的是Wyatt公司研发生产的Dynapro动态激光酶标仪。检测用的微孔板是384孔的微孔板，这是一种工业化动态激光酶标仪检测使用的微孔板，每一微孔孔腔的容积为20μL。96孔和1536孔的微孔板以及标准的低容量微孔板也是可以使用的。板中的微孔孔腔只使用一次，因此不会出现样本的交叉污染。

这里所述的检测样本是一种单克隆抗体。检测时抗体浓度为3~10mg/mL。粘度检测时使用的示踪粒子为水力半径50nm的聚苯乙烯颗粒。由于被测样本在微孔板中直接检测，因此在检测过程中无需被测样本的传输和运送。因此也省略了清洁微孔板、手工向微孔板孔腔中装填样本的等待时间了。利用剩下的这些时间可以检测更多的样本，或者对同一样本进行多次检验。纯聚苯乙烯颗粒的检测得出的结果是50nm的水力半径（Rh）。在蛋白质溶液检测中，得到了在受粘性蛋白浓度影响的、大小为50~63nm的颗粒。根据期望的和检测到的颗粒大小比例关系，可以利用斯托克斯—爱因斯坦方程计算出真实的粘度值。

完成了一系列的纯抗体水力半径的检测之后，就可以得出不同浓度对应的粘度值和水力半径值了。相关人员指出，根据扩散常数（kD）的浓度相关性可以测得蛋白质的解离常数：Dm=Ds+DskDC，式中的Dm是不同浓度时检测到的扩散系数，Ds是样本浓度C=0mg/mL时的扩散系数。

根据梯度方程（2.39×10-8m-2/s）可计算出扩散常数（kD）的值（0.35mL/g）。根据下述公式可以计算出第二维里系数A2，即kD = 1.06 A2MW-8.9，式中的MW是被测蛋白质单体的摩尔质量。这样，被测单抗体的第二维里系数A2为（5.58e-5molmL/g2）。

小结

迄今为止，直接检测粘度和第二维里系数的检测一直要使用很多的样本并持续很长时间。利用本文介绍的自动化检测方法则能够在微孔板中花费不到1h的时间完成粘度和第二维里系数的检测，并且所使用的浓度为100mg/mL的抗体原液少于100μL。

因此，这种蛋白质粘度、聚合性能、溶解性和离解常数检测方法所需的检测样本量明显少于目前所使用的传统检测方法。这种检测方法也可以在1536孔的微孔板中完成。此时，可以把样本容积减少到最低到每孔腔1.5μL，减少大约30%。

散射光法的检测原理

当分子在光的电场中受到偶极子的诱导时会发射出散射光。原则上，人们把散射光检测方法分为两类：多角度光散射器尺寸筛析色谱法（MALS）和动态光散射检测法（DLS）。多角度光散射器尺寸筛析色谱法MALS的探测器对分子发出的、不同散射角的散射光光强度进行检测。通过推算得到散射角为零度时的绝对分子质量和分子的回转半径。分子质量是在散射角为零度时测定的，因为由干涉引起的、与散射角度有关的相关性决定了散射光的量。若在散射光探测器中集成一个色谱分析系统，则可对分子质量和分子质量分布、半径分布等进行绝对测量，也就是说，不必首先假设它的大分子形态了。若MALS检测是按照系列稀释的方法进行的，则除了能够完成分子质量和平均半径的检测之外，还能完成第二维里系数A2的测定。这一系数是衡量蛋白质溶解性的一个指标，描述了蛋白质分子与稀释剂之间的相互作用情况。溶解性是缓释、控释方案开发中的一个重要参数。