随着制药工业的迅速发展，中药废水的排放已成为威胁人类健康的污染源之一^[1]。由于中药制药原材料源于中药材，中药废水的产生主要在于中药的清洗、蒸煮、清洁、制剂等过程^[2]，中药废水中含有一些多糖、木质素、鞣质、生物碱、色素和少量的金属离子^[3]，中药废水具有生物降解能力差、有机污染物种类繁多、浓度高且毒性强的特性，处理高浓度有机废水的难度较大，给生态环境和人类健康带来威胁^[4]。

目前物理法、化学法和生物法^[5-7]以及组合工艺处理中药废水是最常用的方法，但处理能力均有限，目前比较成熟的工艺有活性污泥法、氧化沟、AO、A20、SSBR 生物膜法、曝气生物滤池、接触氧化床等，这些工艺都是依靠微生物的氧化分解作用，通过微生物的代谢作用进行物质转化，将污水中的各种大分子复杂的有机物降解为小分子简单的物质^[8-9]。目前，对活性污泥的研究主要集中在污水处理的不同反应阶段以及不同处理对象的沉淀池活性污泥微生物群落的生态演替规律，活性污泥中的微生物群落组成及功能菌群也非常的丰富^[10]。

本试验选取的制药厂进行污水处理一共分为进水口、曝氧池、好氧池、沉淀池以及出水口五个阶段，其中用于进行污水处理的有进水口、曝氧池和好氧池 3 个阶段，因此，本试验从进水口、好氧池和曝氧池 3 个阶段中筛选微生物菌株，了解 3个阶段在污水处理过程中是否存在其他有害微生物，及时采取应对措施并加强管理，可以有效降低对环境和健康的潜在威胁。

Part1 材料与方法

样本采集于贵州省某制药公司，进水口、好氧池和曝氧池三个阶段的水样。

(1)葡萄糖蛋白胨培养基(富集培养基)：葡萄糖 6 g、蛋白胨 2 g、磷酸二氢钾 1 g、7 水硫酸镁 1 g，pH 7.2~7.5，121 ℃高压灭菌 20 min。

(2)驯化选择培养基：磷酸铵 3 g、12 水磷酸氢二钠 1.26 g、磷酸二氢钾 0.5 g、7 水硫酸镁 0.2 g，微量元素 1 mL，pH 7.2~7.5，121 ℃高压灭菌 20 min。其中，微量元素：7 水硫酸铁 0.5 g、氯化钙 0.15 g、1 水硫酸锰 0.09 g、7 水硫酸锌 0.27 g，1000 mL 蒸馏水。

(3)菌种分离培养基：加入 24 g 琼脂在驯化选择培养基中，以中药废水代替蒸馏水，其他元素与驯化选择培养基相同。

取进水口、曝氧池、好氧池 3 个不同阶段下废水，每种废水 3 个平行处理，按 50 mL/瓶进行分瓶灭菌，121 ℃灭菌 20 min。取不同阶段的活性污泥混合液 5 mL，按 1 %(V/V)接种量接入50 mL富集培养基中，每个处理进行3个平行，以30 ℃，120 r/min条件下振荡培养，72 h 为一个周期，反复富集 3 三个周期。

以中药废水为唯一的碳源，不额外添加其他的外加碳源；将在富集培养条件下的混合菌液 50 mL 接种在驯化选择培养基中，以 30 ℃，120 r/min 条件下振荡培养，中药废水初始添加量为培养液的 20 %，按 40 %、60 %、80 %、100 %添加量依次加入驯化培养基中，每隔 6 h 取样测定培养液菌浊(OD600)的变化情况，以驯化培养基作为试剂空白，培养基明显浑浊后，然后将此浑浊液按 1 %接种量接入新鲜驯化培养基中，同时接入 40 %无菌中药废水，在 30 ℃，120 r/min 条件下振荡培养，每隔 24 h 测一次 OD600(以各自浓度梯度培养基作为空白)直至菌液明显变浑浊，再转接下一个梯度，直到 100 %。

取选择驯化培养时中药废水最高浓度的混合菌培养液作为菌种分离的菌源，以中药废水代替蒸馏水，在无菌条件下反复进行平板划线分离纯化。

使用 DNA 提取试剂盒获取基因组 DNA，并利用 16SrDNA 通用引物 27 F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492 R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)进行 PCR 扩增。PCR的反应条件为：95 ℃预变性 3 分钟；94 ℃变性 1 分钟；56 ℃退火 1 分钟；72 ℃延伸 2 分钟，循环 30 次；最后在 72 ℃延伸 10 分钟并在 4 ℃终止。PCR 产物经过试剂盒纯化后送至上海生物工程有限公司进行序列测定。

接种菌种在牛肉膏蛋白胨平板上培养 48 h 后观察其菌落形态特征及显微形态特征。生理生化特征的鉴定参照《微生物实验教程》中相关方法进行。

Part2 结果与分析

富集培养是在混合菌群中培养特定优势菌种，增加其数量比例，达到纯培养的一种培养方法。经富集培养后，其他非目标微生物也会不断增殖，因此经富集培养后将得到浑浊度杂菌培养液。本试验中，取进水口、曝氧池、好氧池 3 个不同阶段下废水，按活性污泥混合液 1 %(V/V)的接种量接入 50 mL 富集培养基中，以 30 ℃，120 r/min 条件下振荡培养，以 72 h为一个周期，反复富集 3 三个周期，得到的杂菌培养液，如图1 所示。

A：好氧池富集培养第一阶段 72 h 培养前；B：曝氧池富集培养第一阶段 72 h 培养前；C：进水口富集培养第一阶段 72 h 培养前；a：好氧池富集培养第三阶段 216 h 培养后 b：好氧池富集培养第三阶段 216 h 培养后 c：好氧池富集培养第三阶段 216 h 培养后

图 1 菌种的富集培养

以中药废水初始添加量为培养液的 20 %，按 40 %、60 %、80 %、100 %添加量依次加入驯化培养基中。本试验中，在好氧池中，中药废水添加量为 40%时，菌液 OD600 值 0.877，达到最大值；在曝氧池中，中药废水添加量为 40 %时，菌液OD600 值 0.163，达到最大值；在进水口中，中药废水添加量为 80 %时，菌液 OD600 值 0.153，达到最大值；以上的结果表明，当中药废水比例提高至 40 %时，好氧池与曝氧池能适应该浓度有机物的微生物种类相同，菌株生长能力均达到最大值，但随着高浓度中药废水量的提高，耐受性的菌种种类和数量逐渐降低，菌株生长均受到不同程度的抑制。当中药废水比例提高至 80 %时，进水口能适应该浓度有机物耐受性的菌种种类和数量及菌株生长能力均达到最大值。

图 2 不同比例制药废水梯度 OD600

本试验中，从中药制药厂污水中对微生物进行筛选并鉴定，一共获得 11 株菌株，其中，在好氧池中，一共筛选得到4 种菌株，分别为 Klebsiella pneumoniae strain(肺炎克雷伯氏菌)、Bacillus subtilis strain(枯草芽孢杆菌菌株)、Bacterium strain(细菌菌株)和 Chryseobacterium gleum strain(粘金黄杆菌)，其中，肺炎克雷伯氏菌，克雷伯氏杆菌为条件病原菌，主要寄生于动物呼吸道或肠道，是引起人类肺炎的病原菌之一；在曝氧池中，一共筛选到 3 种菌株，分别为 Acinetobacter sp(不动杆菌属)、Klebsiella pneumoniae subsp(肺炎克雷伯氏菌亚种)和 Acinetobacter baumannii strain (鲍曼不动杆菌株)，其中鲍曼不动杆菌株为条件致病菌。在进水口中，一共筛选到 7种菌株，分别为 Pseudomonas nitroreducens strain(硝基还原假单胞菌)、Bacterium strain(细菌菌株)、Sphingobium yanoikuyae strain(矢野口鞘氨醇菌)、Agrobacterium tumefaciens strain (根癌农杆菌菌株)、Pseudomonas nitroreducens strain 硝基还原假单胞菌中的 Pseudomonas nitroreducens strain(硝基还原假单胞菌)、Pseudomonas aeruginosa strain (铜绿假单胞菌)以及Microbacterium sp. Strain 微细菌属中的 Microbacteriaceae bacterium( 微 细 菌 科 细 菌 ) 、 Microbacterium laevaniformans strain(产左聚糖微杆菌)，假单胞菌属广泛分布于自然界水中，土壤及人和动物体表，属于条件致病菌；铜绿假单胞菌为革兰氏阴性菌、好氧，属致病菌。

硝基还原假单胞菌(图 3 A、C)为革兰氏阴性，菌落半透明，菌落无规则，表面光滑；矢野口鞘氨醇菌(图 3 B)为革兰氏阴性、好氧，最适生长温度 30 ℃；肺炎克雷伯氏菌(图 3 D)革兰氏阴性杆菌，菌落白色、无规则，兼性厌氧；粘金黄杆菌(图3 F)，菌落为圆形，黄色，不透明，表面光滑，边缘整齐；细菌(图 3 E)无荚膜，无芽孢，革兰氏染色为阴性；不动杆菌属(图3 G、J、K)菌落黄色、无规则；肺炎克雷伯氏菌亚种(图 3 H、I)革兰氏阴性杆菌，菌落淡粉色、白色无规则，兼性厌氧。

A-C：进水口阶段；D-F：好氧池阶段；

G-K：曝氧池阶段；k：显微镜下形态

图 3 3 个阶段微生物菌种的形态