生物药蛋白的异构体分析

2023-01-12

蛋白类药物具有的翻译后修饰，如糖基化、N末端的焦谷氨酸化、C末端的赖氨酸截除、氧化、脱酰胺等，这些不同的翻译后修饰组合可使蛋白分子产生无数种电荷异构体。另外，单抗在特定的条件下会发生降解、断裂，形成低分子量的片段。这些异构体对于蛋白药物的稳定性及生物学功能发挥具有重要影响，需要用合适的方法进行分析。

丹纳赫生命科学拥有用毛细管电泳法（CE）检测单抗的纯度及蛋白电荷异构体的解决方案。

CE-SDS进行单抗纯度及大小变异体的检测。

CE-SDS蛋白凝胶电泳是采用液态凝胶作为筛分介质，根据不同分子量大小的样品在凝胶中不同的迁移时间将其区分，从而进行大小变异体检测。

将单抗与 β-巯基乙醇或碘乙酰胺混匀进行前处理后，进行还原及非还原的纯度分析。该方法有两种分析分离的模式，分别为高分辨率（High Resolution, HR）和快速（High Speed, HS）模式。HR下样品从进口端到检测窗口的距离为20.0 cm。HS下样品从进口端到检测窗口的距离为10.2 cm。HS模式的分辨率略有下降，但是相比HR模式能够带来更快速的分析（HS大约需要15 min，HR大约需要30 min）。

通过还原处理，可得到单抗的轻链、非糖基化重链以及重链，其中非糖基化重链和重链能够达到基线分离。在非还原法中，得到了轻链、重链、二重一轻链、非糖基化的IgG以及IgG主体。

HR电泳模式 HS电泳模式

另外，还可以用激光诱导荧光 (LIF)的检测方式，对单抗分子大小异构体进行高灵敏的检测，灵敏度可比UV高10倍。

UV（紫外）下与LIF下对同一个单抗进行CE-SDS的电泳图谱

等电点及电荷异构体的检测

毛细管电泳仪可以采用等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing, cIEF）及区带电泳（Capillary zone electrophoresis CZE）两种方式对蛋白电荷异构体进行表征。

在cIEF的分离过程中，毛细管左右两端施加的高压电场使得阳极液和阴极液中的氢离子和氢氧根离子相向运动，其内部填充的两性电解质在酸性（阳极）溶液和碱性（阴极）溶液所形成电场的作用下形成连续的pH梯度，从而使得两性化合物向各自等电点（pI）迁移，可以得到不同电荷异构体的峰。

采用同一种分离方法，CE能够在宽pH范围内对多种单抗进行cIEF分析。此种方法使用三种PI marker，等电点计算值更加准确；分离使用30cm长的毛细管，能够获得较高的分辨率。

三种单抗CIEF电泳图一种单抗的六种CIEF重复性结果

cIEF是一种根据蛋白各亚型等电点的变化分离电荷异构体的方法，需要在涂层毛细管中进行聚焦和迁移，分辨率高，但是分析时间较长，因此还可以采用区带电泳CZE的模式快速对蛋白电荷异构体进行分析。可使用EACA作为两性电解质，TETA作为动态涂层，HPMC作为筛分基质对蛋白的电荷异构体进行分离，只需12分钟就可得到高分辨率和高重现性的分离结果。