通过两个活性抗体臂进行靶向增强，使得双特异性抗体 (bsAb) 对于癌症和其它疾病的治疗极具吸引力。然而，它们的纯化可能比传统单克隆抗体 (mAb) 更具挑战性，因为与所需 bsAb 高度相似的产品相关杂质水平增加。层析填料的进步有助于简化下游操作并提高分离性能。

与产品相关的杂质占主导地位

除了单克隆抗体中出现的与工艺相关的杂质外，双特异性抗体生产通常会产生与产品相关的杂质，这些杂质很难与所需产品分离。Lonza 全球技术和 CMC 总监 Russell Overbeck 表示，这些杂质主要包含错配变体，包括同二聚体、半聚体等。“根据双特异性抗体的形式，在下游工艺过程中通常需要去除同二聚体、片段或半抗体，”KBI Biopharma 工艺开发副总裁 Leslie Wolfe 表示同意。

“因此，纯化双特异性抗体的最大挑战是将目标分子与错配变体分离，”Overbeck 说道。Cytiva 首席科学家 Eva Heldin 评论道，某些双特异性抗体的难度可能会增加，因为它们倾向于聚集和/或对较低 pH 条件敏感，这可能导致降解、错误折叠或其它结构变化。

从积极的角度来看，Wolfe 观察到双特异性抗体的设计方式和/或细胞系如何表达双特异性抗体可能会减少纯化挑战。例如，她指出，等电点 (pIs) 与异二聚体不同的同二聚体的分离比具有相似电荷的同二聚体的分离更简单。同时，半抗体或其它产品相关杂质的去除难度可能取决于它们在澄清收获物中的水平。

熟悉的层析步骤

标准 mAb 所采用的纯化方法通常可以在一定程度上应用于 bsAb。Overbeck 表示，工艺过程通常包括 Protein-A、精制 I 和精制 II 层析。对于给定的双特异性抗体，他指出，根据分子复杂性、pI 和其它因素，这些步骤可能看起来有所不同，但主要仍然包括离子交换 (IEX) 和/或疏水相互作用层析 (HIC) 以及复合模式层析法。

Wolfe 表示，宿主细胞蛋白和宿主细胞 DNA 通常通过阴离子和阳离子交换层析法去除，而错配的变异杂质可能需要替代性亲和捕获填料来去除半抗体或混合模式和/或 HIC 层析法来去除同二聚体，具体取决于 bsAb 的设计。

Heldin 说，Protein A 捕获步骤可去除大部分宿主细胞蛋白和宿主细胞 DNA。然而，她确实观察到，亲和力的差异通常可以设计到亲和填料中，这也可以为与产品相关的杂质提供选择性。“例如，我们已经看到，对于具有 Fc 和 VH3 相互作用的 MabSelect PrismA 填料，如果针对其中一种相互作用的不对称性进行设计，则可以利用亲和力效应来产生不对称的 bsAb，”她解释道。

Heldin 继续说道，几乎总是包括具有阴离子交换特性的层析步骤，以促进良好的病毒清除并在捕获步骤后去除任何残留的 DNA。

高分辨率和选择性至关重要

Heldin 表示，对于双特异性抗体的纯化，层析步骤的选择性至关重要。Overbeck 补充道，高分辨率是最需要的，其次是高动态结合载量和良好的压力/流速特性。

“为了实现这些目标，”Heldin解释说，“纯化过程通常是使用正交相互作用原理、通过各个步骤的结合来设计的。”她指出，重要的是从对产品相关杂质具有选择性的亲和步骤开始，以简化后续的精纯步骤。此外，她说，为了实现具有良好经济性的大规模工艺，填料除了具有良好的压力/流速特性和良好的结合载量之外，还应该在运行之间进行清洁，以实现多个纯化循环。

稳定性同样重要

确保双特异性物质良好的下游纯化性能的关键之一与实际的层析填料无关。它与设计稳定的双特异性抗体有关。“仔细研究双特异性抗体稳定性是一个很好的起点，”Heldin 说。这样做有助于确定 pH 限制和可接受的盐条件。她补充说，这些信息反过来可用于选择确保目标双特异性抗体良好稳定性的工艺条件。

作为一个例子，Heldin 指出，虽然捕获步骤在中性 pH 下操作并且通常是简单的，但在洗脱时可以观察到不稳定性。在这种情况下，洗脱时可能需要立即调整至更高的 pH 值。她还指出，“如果发现 HIC 步骤比离子交换更具选择性，那么在非结合或部分结合条件下运行该步骤可能会更有利，以避免高盐浓度。”

产品和工艺知识推动填料选择

了解双特异性抗体产品的特性以及其生产过程中可能产生的潜在杂质及其特性对于有效选择层析填料是必要的。

“在开发双特异性抗体纯化工艺时，”Wolfe 强调，“了解可能存在的产品相关杂质的生化特性非常重要。具体来说，与潜在的同二聚体相比，bsAb 的等电点不仅对于选择要筛选的填料很重要，而且对于选择要评估的 pH 范围也很重要。”

Wolfe 继续指出，根据 bsAb 的设计和存在的产品相关杂质，特定的亲和捕获填料可能有利于将半抗体与目标 bsAb 分离。“在这些情况下，选择与产品相关杂质中不存在的双特异性抗体区域结合的亲和填料非常重要，”她评论道。

同样，Wolfe指出，了解精纯步骤中可能存在的与产品相关的杂质的生化特性对于选择这些填料非常重要。

Overbeck同意，双特异性的类型及其内在分子特性通常决定需要哪种填料。“百分之九十的情况下，高分辨率阳离子交换都是有效的，”他说。如果不是这样，他观察到疏水相互作用和混合模式填料应该用高通量机器人技术进行筛选，并酌情扩大规模。

Heldin同意应该对用于精纯步骤的填料进行筛选，并强调要牢记必要的正交性。然而，她建议加入具有阴离子相互作用的填料（仅阴离子或混合模式阴离子），并指出精纯步骤的顺序可以稍后决定，始终以尽量减少所需的缓冲液调整和样品制备为目标。

实验和计算机测试

根据多位专家的说法，应该结合物理实验和计算模型来筛选用于双特异性抗体纯化的层析填料。事实上，可能有必要筛选更多的精纯填料，这些填料可能可以提供密切相关的所需的选择性。Heldin 表示，与使用单克隆抗体相比，杂质含量更高，特别是对于之前未使用过混合模式填料的工艺开发人员而言。

例如，根据 Wolfe 的说法，产品相关的杂质通常具有与目标双特异性抗体不同的表面电荷和/或疏水性。“通过对这些杂质进行计算机或实验表征，可以确定目标双特异性抗体与杂质有何不同，并选择填料和操作条件来筛选，以产生最佳的分离效果，”她说。

此外，Wolfe 建议选择具有一定疏水性的填料，即使疏水性来自基球，也有助于开发稳健的分离步骤。她还认为，考虑到双特异性抗体有时具有挑战性的分离，利用双特异性抗体表面的多模式特性通常会产生更稳健的分离。Overbeck 补充道，如果典型的高分辨率阳离子交换填料不起作用，那么使用机器人技术进行高通量筛选是识别最佳填料的最佳策略。

当然，如果没有良好的配套分析，筛选方法就不会有效。Wolfe 表示：“在工艺开发过程中进行分析检测，将双特异性抗体产品与类似杂质区分开来，对于确保稳健的分离步骤至关重要。”

一些新的填料选择

毫不奇怪，用于双特异性抗体纯化的新型填料化学物质集中于改善其与类似产品相关杂质的分离。有些还专注于为更敏感的分子提供有效的解决方案。

Cytiva 推出了多种产品来满足第一个需求。Heldin 评论道：“开发出对双特异性抗体 Fc 结构域以外的其它结构域具有亲和力的填料，使得能够在捕获步骤中（而不仅仅是精纯步骤）对与产品相关的杂质进行选择性处理。”

该公司的新产品包括 MabSelect VL，这是一种基于 Protein L 的填料，对单克隆抗体的 kappa 轻链具有亲和力。Heldin 说：“除了可用于捕获片段外，它还可以用于捕获高选择性的 bsAb，特别是当 bsAb 不对称并且仅在其一个‘臂’上含有 kappa 轻链时。”

Cytiva 还推出了 MabSelect VH3（一种对 bsAb 的 VH3 链具有亲和力的填料）和 Protein Select（一种自切割无痕标签和互补亲和层析填料）。Heldin 表示，后一种技术标准化了任何蛋白质的纯化，无需为每种蛋白质使用特定的亲和结合伴侣。

作为设计用于处理高度敏感蛋白质和抗体的填料的一个例子，Overbeck 强调了 Purolite 的 Praesto Jetted A50 HipH 填料是亲和纯化具有低 pH 倾向的分子的关键发展。

在过去的几年中，尽管分子多样性急剧增加，但几乎没有推出真正新的填料选择。未来几年可能会出现更多的产品，这对于制造这些更复杂的疗法是积极的信号。特别是，预计会有更多利用纳米纤维化学物质的潜在选择。

原文：C.A.Challener, Selecting Chromatography Resins for Bispecific Antibody Purification. Biopharmaceutical International, 2023.

撰稿人 |  生物工艺与技术

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发