本文将介绍采用切向流微滤和超滤技术及层析方法纯化百日咳毒素。用中空纤维微滤工艺替代传统离心机分离澄清百日咳菌液，用Omega T型筛网5KD超滤膜包对澄清料液浓缩并置换缓冲液。随后进行阴离子层析和羟基磷灰石层析纯化百日咳毒素。百日咳毒素可通过高盐抽提、切向流澄清和浓缩，以及DEAE HyperD阴离子交换层析和HA Ultrogel羟基磷灰石两步层析达到较好纯度和回收率。

百日咳（pertussis, whooping cough）是由Bordetella Pertussis（百日咳杆菌，博德特氏菌属）感染引起的急性呼吸系统传染病，传染性较强，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿常见，是严重威胁人类健康的主要传染病之一[1]。百日咳在发病初期传染力极强，不易诊断，因此进行疫苗接种是预防和控制百日咳最经济最有效手段[2]。

百日咳杆菌其致病物质主要包括百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)、丝状血凝素（Filamentous Hemagglutinin，FHA）、百日咳杆菌黏着素(Pertactin，PRN)、凝集原(Agglutinogens，AGGs)、腺苷酸环化酶毒素(Adenylate Cyclase Toxin，ACT)、气管细胞毒素(Tracheal Cytotoxin，TCT)和不耐热毒素(Heat-labile toxin，HLT)等多种生物活性物质，这些生物活性物质在百日咳杆菌的致病作用和引起宿主对疾病的免疫反应方面起着重要作用[3]。

无细胞百日咳疫苗的发展趋势，是通过纯化手段去除无用且引起副反应的组分（如HLT、TCT和ACT），保留并提纯具有保护性免疫作用的抗原成分（如PT、FHA和PRN等[4]）。本文通过使用切向流技术，选取适宜的层析填料，分离纯化百日咳毒素（PT），为大规模制备高纯度百日咳疫苗奠定基础。

材料、试剂及主要设备

百日咳菌体，百日咳培养液离心上清；氯化钠、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等均为分析纯、三（羟甲基）氨基甲烷为生物试剂。

中空纤维膜柱UJP-1147R(面积0.19m2，精度0.65μm，颇尔公司)，平板膜包OS005T12（面积0.1m2，截留分子量5KD，颇尔公司），DEAE Hyper D阴离子交换层析填料（颇尔公司），HA Ultrogel羟基磷灰石层析填料（颇尔公司）

Centramate切向流系统（颇尔公司）、中空纤维切向流系统（颇尔公司），pH计，电导率仪，中低压层析系统，电泳检测设备及相关检测用试剂（伯乐公司）。

实验方法

1.菌体的抽提及超滤：菌体用0.5M NaCl缓冲液混悬抽提1hr。用UJP-1147R中空纤维进行超滤浓缩及洗滤。收集菌体混悬液和澄清透过液。

2.澄清液的浓缩：用OS005T12膜包对1步骤中澄清液超滤浓缩50倍并洗滤置换缓冲液为80mM NaCl缓冲液。

3.DEAE HyperD层析：样品2经DEAE Ceramic HyperD阴离子交换层析纯化，收集流穿样和洗脱样。电泳检测分析蛋白成分和纯度。

柱直径1.5cm，高8.5cm，体积15ml；

平衡缓冲液A: 20mM Tris-HCl + 80mM NaCl；

洗脱缓冲液B: 20mM Tris-HCl + 500mM NaCl；

层析流速：170cm/hr，线性梯度洗脱。

4.HA Ultrogel层析：3步骤中得到的流穿样品直接上HA Ultrogel层析纯化，收集洗脱样品电泳检测。

柱直径2.5cm，高8cm，体积39.25ml

平衡缓冲液A: 5mM PB + 100mM NaCl

洗脱缓冲液B: 500mM PB

层析流速：30cm/hr，线性梯度洗脱

5.电泳检测：样品进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

实验结果

切向流澄清及浓缩实验结果

表1中列出了中空纤维膜柱澄清菌体发酵液和澄清液超滤浓缩的工艺数据。菌体发酵液澄清过滤工艺曲线见图1a,澄清液超滤浓缩工艺曲线见图1b,各步骤样品电泳图谱见图2。

用0.5M NaOH和500ppm NaClO在25℃下清洗30min，膜净水滤速都能够达到实验前的水平，说明该清洗工艺能够较好的去除膜上的污染物。

层析纯化结果

超滤后的浓缩液经DEAE HyperD进行初纯，收集流穿峰共106ml，层析图谱见图3，电泳图谱见图4。根据图谱可以看出，PT蛋白不结合在阴离子交换介质，直接穿透，而大部分菌体杂蛋白被阴离子层析介质吸附。

第一步层析后流穿峰106ml样品作为上样溶液进行第二步HA Ultrogel层析纯化，层析图谱见图5，电泳图谱见图6。根据图谱可看出，羟基磷灰石层析穿透峰中含高纯度PT蛋白。

小结

传统的无细胞百日咳疫苗生产工艺包括大规模发酵罐培养细菌、硫酸铵沉淀、高盐抽提、透析、脱毒和蔗糖梯度超离心等步骤，影响因素多，抗原纯度提高受限[5]。本实验首先利用高盐溶液抽提及切向流技术对百日咳毒素进行了初步纯化，后续采用DEAE HyperD和HA Ultrogel两步层析，以流穿方式纯化百日咳毒素蛋白，获得了很高的纯度。

对菌体发酵液的前处理工艺上，采用了精度为0.65μm精度的UJP-1147R中空纤维膜柱替代传统的离心机。该步骤精度既可以有效的截留完整菌体，同时也最大程度的增加抽提液中百日咳毒素的透过效率；中空纤维澄清后的蛋白溶液经过OS005T12平板膜包系统进行超滤浓缩及洗滤，在保证高蛋白回收率的同时，提高蛋白浓度并更换缓冲液，与下一步的层析纯化实现顺畅对接。采用中空纤维及平板膜包切向流超滤技术可实现符合cGMP要求的全封闭（或半封闭）操作，达到澄清（去除菌体）、浓缩、除盐（更换缓冲液）多种功能，耗能低，并且全过程可参数控制。

1991年，Tan等建立了用珍珠岩及羟基磷灰石为材料分离提取PT抗原的方法，纯化后的PT得率可达62%。羟基磷灰石的主要作用是去除了杂质，并有效浓缩了抗原，抗原纯度高达95%。但是片状或球状的烧结填料对较大直径层析住装填效果不佳，柱效重现性差，柱内发生菌体蛋白或毒素蛋白的吸附/沉淀后，填料容易板结且不易再生，上述缺点严重限制了毒素蛋白层析纯化的产业化进程。本实验采用的DEAE HyperD填料的基质是布满孔道的刚性圆珠颗粒，并被带有功能基团的水性凝胶包被和填充。这就使这种填料有很好的刚性和流速表现，以及独特的物料传递和动力性特性。同时HA Ultrogel是一种改良型羟基磷灰石填料，采用了有良好孔隙率和化学稳定性的交联的琼脂糖包埋羟基磷灰石微晶体，形成符合微球体；这一特性改善了片状或球状填料的浮降特性，填料颗粒之间不易发生挤压破碎和聚集板结，适合从小规模至100L以上的大层析柱的高柱效装填。

PT的纯度及生物学检定方法很多，其中体外检测就其特异性和敏感性来说，ELISA不失为一种特异、简单、快速、敏感的检测方法，而电泳法检测敏感，纯度显示简单明了，其纯度测定需要凝胶成像分析系统进行鉴定；另外体外CHO细胞簇聚反应操作简便、迅速、敏感。动物体内法虽能反应PT在体内的活性，是评价疫苗的首先方法，但由于存在动物个体差异，影响因素诸多，因此并非为评价PT纯化效果的理想方法。因此应综合评价PT的生物学活性及纯化效果。

参考文献：

[1] 张庶民，徐颖华.我国百日咳疫苗现状及展望[J]. 中国药事2005，19（11）：685.
[2] Robinson A, Irons L I, Ashworth L A. Pertussis vaccine: present status and future prospects[J]. Vaccine, 1985, 3(1):11-12.
[3] R. Parton. Review of the biology of bordetella pertussis [J]. Biologicals, 1999, 27 (2):71
[4] World Health Organization. Department of vaccine and other biologicals: Informal consultation on the control of pertussis with whole cell and acellular vaccines [R]. The world health report, 1999, (3):1
[5] Sato Y. Development of pertussis component vaccine in Japan. Lance 1984, 21:122