油浴仪测定生物指示剂菌种在氯化钠注射液中 D 值影响因素研究

申景丰蒋芙蓉汤平余卫国夏博陈超 2025-01-23

本文以研究油浴仪法测定 D 值的影响因素为目的，采用残存曲线法多次测定同一批嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中的 D 值，根据不同条件下 D 值测定结果的比较，确定 D 值测定的影响因素。通过比较 0.05 mL、0.5 mL、1.0 mL 三种菌液量，以及毛细管、安瓿瓶两种分装方式的测定结果发现，安瓿瓶分装 0.5 mL 菌液 6 次测定 D 值均在标示 D 值的 80％～ 120％之间，测定结果准确稳定。因此，本文建议油浴仪测定 D 值时将菌液分装在安瓿瓶中，每瓶分装 0.5 mL，并关注油浴仪温度的均匀性和稳定性。

在湿热灭菌工艺中，可以通过检验生物指示剂灭菌后的存活情况来验证灭菌效果 ^[1-5]。生物指示剂是指将特殊活微生物采用特定方法制备成对特定灭菌工艺有耐受性的一种生物制品，一般选用比普通微生物有更强耐受性的微生物^[4]。生物指示剂目前主要有三种类型：芽孢悬液型、自含式、载体型生物指示剂 ^[6-10]。

评估生物指示剂的关键技术参数主要有总芽孢数、D 值。总芽孢数即产品存活孢子数。D 值指在一定暴露条件下，将试验微生物杀灭 90% 所需的灭菌时间 / 剂量 ^[11-13]。D 值越大说明微生物死亡速率越慢，耐热性也越强。D 值会受到菌种、细菌或芽孢菌悬液的性质、灭菌温度 / 剂量影响，不受初始细菌数量的影响。

D 值在灭菌设备的性能确认、特定灭菌工艺的开发、生产过程灭菌效果的检测及评估方面具有重要作用。检测 D 值的方法主要有阴性分数法和残存曲线法^[14]，测定的 D 值应在标示 D 值的 80％～120％之内。

为验证拟定的灭菌工艺是否能让产品达到要求的无菌保证水平，本研究以油浴仪测定嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中的 D 值为例，分析油浴过程并确定关键点，建立油浴仪残存曲线法测定 D 值方法，测定嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中的 D 值，并根据试验结果指导产品灭菌工艺生物学挑战验证。

Part.01

材料

本实验主要使用以下试剂、培养基和仪器（见表 1、表 2、表 3、表 4）。

表 1 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子悬液产品信息

表 2 试验样品

表 3 培养基

表 4 仪器

Part.02

方法与结果

采用油浴仪测定嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中的 D 值，分析油浴过程并确定关键点，建立油浴仪残存曲线法测定 D 值方法。

2.1 油浴仪结构

油浴仪是一种可以设定 100℃以上的恒温设备，由机箱、恒温油槽、控温系统等 3 部分组成。油浴仪以硅油为介质，控温系统控制油浴仪的各个位置温度的均一性。结构见图 1。

图 1 油浴仪结构图

2.2 供试品 D 值测定试验方法

菌液体积选择 0.05 mL、0.5 mL、1 mL 三种，其中 0.05 mL 菌液每组共 6 支毛细管；0.5 mL 和 1 mL 菌液每组共 4 支。

2.2.1 孢子悬液的供试品溶液制备

取合格的孢子悬液，加入到氯化钠注射液中，将孢子悬液制备成孢子数为 5×10⁵ ～ 5×10⁶ cfu/mL 的供试品溶液。其中，0.05 mL/ 支毛细管的 D 值测定孢子悬液取样体积为 0.05 mL ；安瓿瓶测定需要菌液体积孢子悬液体积分别为 0.5 mL 或 1 mL。

2.2.2 分装和密封

采用注射器将 0.05 mL 菌液注射至毛细管中，采用移液器将 0.5 mL、1 mL 菌液转移至安瓿瓶中。采用酒精喷灯对上述样品进行封口，封口时避免酒精喷灯火焰对孢子造成损伤。封口后，进行封口效果检测，排除漏液的样品。

2.2.3 灭菌处理

将制备好的含孢子悬液的供试品分为 7 组，于 121℃恒温油浴锅中进行灭菌处理，每组灭菌时间分别为 0 min、 2.5 min、5 min、7.5 min、10 min、 12.5 min、19 min。灭菌后，样品放入冰水中冷却，并冷藏，在 2 h 内进行残余孢子计数。

2.2.4 残余孢子计数

将各试验组样品，置于超声波仪上充分混匀，表面消毒后，取出供试品液（尽可能全部取出，无明显残留）。未经灭菌处理的样品在 95℃～ 100℃水浴热激 15 min（以供试品达到设定温度开始计时），热激完成后取出样品，迅速放入冰水中冷却。采用 10 倍递增稀释法，逐级稀释至适宜梯度进行计数，其余组混匀后直接稀释计数。

2.2.5 数据处理

根据培养计数结果，取灭菌时间为横坐标，存活孢子数的对数值为纵坐标作图，D 值为该直线斜率的负倒数，计算嗜热脂肪芽孢杆菌孢子在溶液中的D 值。

计算公式：y= kx+b D_121℃ = -1/k （式中：k 为直线方程式的斜率）。

结果判断：计算出孢子悬液在产品介质溶液中的 D 值与孢子悬液标示 D 值比较，判断所测 D 值是否在标示 D 值的 80% ～ 120% 范围内，线性回归 R2 需大于 0.80。

2.3 试验结果

采用油浴仪对孢子悬液 D 值测定共 10 次：其中分装 0.05 mL 菌液（采用毛细管分装）试验 2 次；1 mL 菌液（采用安瓿瓶分装）试验 2 次；0.5 mL 菌液（采用安瓿瓶分装）试验 6 次。

2.3.1 0.05 mL 菌液 D 值测定结果

采用毛细管分装 0.05 mL 菌液，样品分为 7 组，每组 6 支，油浴后，进行残余孢子数计数。共试验 2 次，结果见表 5。

表 5 0.05 mL 菌液 D 值测定

2.3.2 1 mL 菌液 D 值测定结果

采用安瓿瓶分装 1 mL 菌液，样品分为 7 组，每组 4 支，灭菌时间间隔为 2.5 min，油浴后，进行残余孢子数计数。共试验 2 次，计数结果见表 6。

表 6 1 mL 菌液 D 值测定

2.3.3 0.5 mL 菌液 D 值测定结果

采用安瓿瓶分装 0.5 mL 菌液，样品分为 7 组，每组 4 支，灭菌时间间隔为 2.5 min，油浴后，进行残余孢子数计数。共试验 6 次，计数结果见表 7。

表 7 0.5 mL 菌液 D 值测定

2.3.4 D 值计算

取灭菌时间为横坐标，存活孢子数的对数值为纵坐标，D 值为该直线斜率的负倒数，计算公式：y=kx+b，D_121℃ = -1/k （式中：k 为直线方程式的斜率）。D 值计算结果见表 8。

表 8 D 值计算结果

Part.03

讨论

3.1 D 值测定结果分析

根据油浴仪残存曲线法 D 值测定结果分析，由表 8 可知：采用 0.5 mL 菌液体积的试验，测定 D 值为标示 D 值的 91%、119%、110%、 111%、115%、113%，均在标示值的 80% ～ 120% 之间，而采用 0.05 mL 菌液体积测定 D 值为标示 D 值的 124%、148%，采用 1 mL 菌液体积测定 D 值为标示 D 值的 145%、156%，均未在标示 D 值的 80% ～ 120% 之间。因此采用 0.5 mL 菌液体积进行 D 值测定较好，测定 D 值更准确。

3.2 不同菌液量之间的比较

不同的菌液体积影响了菌液的分装载体，0.05 mL 菌液体积采用毛细管分装，0.5 mL 和 1 mL 菌液采用安瓿瓶进行分装。①样本用量比较：采用毛细管进行 D 值测定，每组样品≥ 6 支，安瓿瓶每组样品≥ 4 支，在分装次数上安瓿瓶分装次数少于毛细管，但总体积为毛细管最少。②分装方法比较：毛细管采用注射分装体积，分装时针头需伸入毛细管中，而安瓿瓶采用移液器进行分装，因此采用安瓿瓶分装比毛细管分装更简便。③载体比较：载体不同也会对样品孢子回收率产生影响，毛细管体积少，回收困难，回收率低。④油浴温度的影响：菌液体积越大吸收的热量越多，对油浴温度的影响也越大，对样品的灭菌效果出现较大的影响。

3.3 仪器性能对于 D 值测定的影响

影响测定嗜热脂肪芽孢杆菌在氯化钠注射液中 D 值的主要因素为温度、时间，而其中温度对于灭菌效果的影响非常显著。采用油浴仪进行 D 值测定，油浴仪对温度稳定控制较弱，采用循环管道平衡各位置的温度，受循环泵和硅油流动速度的影响，油浴仪各位置温度均一性较差。由于油浴仪内的样品放置的位置不同，因此每个样本所处位置的温度不完全一致，放入样品后，吸收热量导致局部温度出现下降，灭菌效果下降，可能会对测试结果有一定影响。这也可能是上述实验结果中测定的 D 值均比标示 D 值大的原因之一，真实值比测定值小，出现误差。因此，测定 D 值所需的硬件设备对于 D 值测定准确性至关重要。

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