注射用门冬氨酸鸟氨酸，适应症为治疗因急、慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎所致的高血氨症，特别适用于因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状的解除及肝昏迷的抢救—— 根据中国药典2015 版四部无菌检查法的规定，建立药品无菌检查法时，应该进行方法学验证，以证明方法的适用性。为确保该产品无菌检验方法科学，结果准确，本文建立了注射用门冬氨酸鸟氨酸无菌检查方法，并对检查方法进行了验证。

实验目的是建立注射用门冬氨酸鸟氨酸无菌检查方法，并对方法进行验证。方法按《中国药典》2015 版四部1101 无菌检查法进行方法学验证。结果：用 0.1% 无菌蛋白胨水溶液作为稀释剂进行稀释，并用0.1% 无菌蛋白胨水溶液作为冲洗液进行冲洗，采用薄膜过滤法进行过滤，加相应的培养基进行培养，六株试验菌供试品阳性对照与阳性对照比较均生长良好，符合验证要求。结论：验证所建立的方法可用于注射用门冬氨酸鸟氨酸的无菌检查，结果准确、可靠。

实验仪器与材料包括：XG1.DWXD-0.36 型脉动真空灭菌器( 山东新华医疗器械厂)，HTYIII型智能集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司)，KDGB220、KDGB330 型一次性全封闭集菌培养器( 杭州泰林生物技术设备有限公司)，LRH-250-II 型、LRH-250 型生化培养箱(广东省医疗器械厂)，注射用门冬氨酸鸟氨酸(规格2.5g，杭州澳亚生物技术有限公司生产，批号14112814、14120114、14120414)。试验用菌株：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003] ;大肠埃希菌[CMCC(B)44102];铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104];枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501];生孢梭菌[CMCC(B)64941];白色念珠菌[CMCC(F)98001];黑曲霉[CMCC(F)98003]。(上述菌种由中国医学微生物菌种保藏中心提供)。验证用培养基：硫乙醇酸盐流体培养基;胰酪大豆胨液体培养基;胰酪大豆胨琼脂培养基;沙氏葡萄糖琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基。( 上述培养基由杭州微生物试剂厂提供) 。稀释剂及冲洗液：0.1% 无菌蛋白胨水溶液(杭州澳亚生物技术有限公司配制)。菌液稀释剂：0.9% 无菌氯化钠溶液(由山东齐都药业有限公司提供)。

方法与结果

菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，32.5 ℃培养24 h ;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基，22.5 ℃培养36 h ;上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml 含菌数小于100 cfu 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，于22.5 ℃培养5 天，加0.9% 的无菌氯化钠溶液5 ml，将孢子洗脱，用管口带纱布的无菌毛细吸管吸出孢子悬液置无菌试管中。用0.9% 无菌氯化钠溶液制成每1 ml 含菌数小于100 cfu 的菌悬液

菌液计数：分别取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各1 ml 于培养皿中，每种菌平行做两个平皿，加入胰酪大豆胨琼脂培养基;取白色念珠菌、黑曲霉菌各1 ml 于培养皿中，每种菌平行做两个平皿，加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，按规定条件培养(其中生孢梭菌进行厌氧培养)，结果见表1。由表1 可知，各菌种在相应的稀释度下，每1 ml 菌落计数均符合规定。

培养基的无菌性检查：取硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基各8 支，在相应培养条件下培养14 天，结果显示两种培养基的无菌性符合规定，见表2。(注“+”代表有菌生长，“-”代表无菌生长，以下表格符号意义相同)。

培养基的灵敏度检查：取每管装量为12 ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7 支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各两支，另一支不接种作为空白对照，培养3 天;取每管装量为9 ml 的胰酪大豆胨液体培养基7 支，分别接种小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各两支，另一支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。结果见表3，由表3 可知，培养基的灵敏度试验结果符合规定。

薄膜过滤法方法学验证 取每批供试品180 支， 用0.1% 无菌蛋白胨水溶液溶解供试品并冲洗，每10 支为一组，分成18 组，每组使用一个过滤器，其中六组冲洗量为100 ml，另6 组冲洗量为200 ml，再6 组冲洗量为300 ml,在最后的一次冲洗液中加入每1 ml 小于100 cfu 的试验菌1 ml，过滤后，将相应的培养基100 ml加至各滤筒内作为供试品的阳性对照(PPC)。另取集菌培养器，不过滤供试品，其他操作同上作为阳性对照(PC)。按规定的温度培养3~5 天，各试验菌同法操作，结果见表4、表5、表6。由表4~6 可知，3 批产品在设定冲洗量为100 ml、200 ml、300 ml 条件下，对表6 中菌株而言，供试品阳性对照和阳性对照均生长良好，且无明显差异，均无抑菌作用，因此确定该产品的无菌检查方法为：取本品用0.1% 无菌蛋白胨水溶液溶解，采用薄膜过滤法过滤，用0.1% 无菌蛋白胨冲洗，冲洗量为每管100 ml，加相应的培养基进行培养。

样品的无菌检查：每批取供试品30 支，用0.1% 无菌蛋白胨水溶液溶解供试品，取三联管全封闭式集菌培养器(KDGB330)过滤， 过滤结束后用300 ml，0.1% 无菌蛋白胨溶液冲洗，每管100 ml，冲洗结束，其中一管加入100 ml 硫乙醇酸盐流体培养基，另一管加入100 ml 胰酪大豆胨液体培养基，第三管加入100 ml 硫乙醇酸盐流体培养基并接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌菌液作为供试品阳性对照;另取稀释液，同法操作，作为阴性对照。按规定温度培养14d，结果见表7。由表7 可知，3 批产品按验证的方法进行检查，供试品阳性对照和阴性对照均成立，产品符合无菌要求。

讨论

根据《中国药典》2015 版四部1101 无菌检查法的要求，无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法，因此本品采用薄膜过滤法进行相应的研究。此外注射用门冬氨酸鸟氨酸为非抗菌药物，因此选择金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。研究结果表明：注射用门冬氨酸鸟氨酸在试验菌液计数及所用培养基无菌性、灵敏度符合规定条件下，三批产品经验证各阳性对照组生长情况均成立，冲洗量为100 ml 和200 ml 和300 ml 的供试品阳性对照组生产情况与阳性对照组菌生长良好，并且无明显差异，无抑菌作用。三批样品经检查，符合无菌要求。因此确定为该产品的无菌检查方法为：取本品，用0.1% 无菌蛋白胨水溶液适量使溶解，用薄膜过滤法过滤后，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗，冲洗量为每管100 ml，依法检查，符合规定。通过上述验证所建立的方法可用于注射用门冬氨酸鸟氨酸的无菌检查，结果准确、可靠。

【参考文献】

1. 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2015 年版(四部). 北京：中国医药科技出版社，2015.6.

2. 药品GMP 指南. 质量控制实验室与物料系统. 北京：中国医药科技出版社.

本文作者供职于杭州澳亚生物技术有限公司。