从1980年代中期，无菌检查隔离器，当时也被称为实验室隔离器，首先在欧洲发展起来。隔离器被证实能够提供微生物测试一个最可靠的环境，该环境能够很好的防止微生物对测试用品的污染，并且避免假阳性的产生。并且在全球制药行业得到了广泛的应用。

随着中国药典、GMP的发展，无菌检查隔离器也更多的被国内制药企业关注。本文针对无菌检查隔离器的法规要求，发展技术背景以及设备特点进行了说明。

1 无菌检查隔离器的法规与技术背景

1.1 与无菌检查隔离器相关的法规

在2010年《中国药典》中的《附录XI H 无菌检查法》[1]中规定“无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，……

而2014年，《中国药典》对微生物实验室的增补征求意见《附录XVIII G 药品微生物实验室质量管理指导原则》中说明，“无菌检查应在B级背景下的A级单向流洁净区域或D级背景下的隔离器中进行，……”

但《中国药典》2015年版通则微生物内容第三次公开征求意见的通知中的《1101无菌检查法》中取消了第二次公开征求意见中对环境要求的明确说明。但是值得注意的是增加了《9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则》，这是中国药典中第一次将隔离器纳入到药典中去。其中提到“无菌检查用隔离器安装环境的洁净度要求建议不低于我国现行GMP 中 D 级空气洁净度要求，安装隔离器的房间应限制无关人员出入。”由此可见，隔离器在无菌检查中的应用已经成为趋势。

以下是国际主流法规机构的文献对无菌检查的相关说明：

USP <1208> 无菌检查 – 隔离器系统验证 ^[2]

“用于实施药典所规定无菌检查的隔离器从1980年代中期就开始使用了。…… 使用隔离器的操作者无需穿着特殊的洁净服来操作无菌检查，标准的实验室服就足够了。…… 无菌检查隔离器不一定要放置于定级的洁净室中，重要的是放置隔离器的区域要对非必要人员的进出限制管理。……房间里无需进行环境监控。……”

PIC/S PI 012-3 无菌检查^[3]

“无菌检查应该在无菌条件下进行，无菌检查的操作环境要求和无菌药品的生产环境一致。……”

PIC/S PI 014-3 用于无菌工艺生产和无菌检查的隔离器^[4]

“当隔离器用于无菌检查时，没有正式要求他们被放置在D级环境。这个环境应当受到控制，例如只允许受过培训的员工进入，但不一定需要定级别。”

1.2 无菌检查隔离器的发展与优势

从1980年代中期，无菌检查隔离器就在欧洲得到了应用[2]，当时也被称为实验室隔离器，并且逐渐地隔离器所提供的无菌环境被认为是执行有争议的微生物测试最可靠的环境，该环境能够很好的防止微生物对测试用品的污染，并且避免假阳性的产生。

在隔离器技术应用于无菌检查之前，执行无菌检查的操作和产生假阳性是关注的重点问题。无菌检查过程中，假阳性产生有以下可能性[5]：

•由操作者在无意识的情况下造成的污染

•在容器表面存在的污染

•测试环境与设施造成的污染

•使用受到污染的试剂和设备, 或者取样的操作产生的污染

质量控制微生物实验室依赖于有效控制的测试环境，适当的产品样本和测试试剂，以及操作者的无菌技巧，才能够保证无菌检查的成功执行。适当的试剂和产品样本可以通过每批次促生长以及产品样本抗菌性和抗真菌性测试来进行验证，但是控制测试的环境和管理控制操作人员的行为则相对困难。

随着隔离器应用于无菌检查，虽然操作方式上并没有简化，有时甚至操作起来不如传统的方式方便，但是受到更可控环境的保护，加强了微生物的控制，并且降低了假阳性的发生，从而提高了测试性能。

Jack Lysfjord在其著作中引用了美国某药厂对无菌检查在洁净室进行与在隔离器中进行产生假阳性和经济损失做的比较，见表一所示[6]：

表一 假阳性: 隔离器 VS 洁净室

另一方面，从使用成本角度考虑，在ISPE的《无菌产品生产设施基础指南》中提到，在使用隔离器时，运行成本大约低于传统洁净室运行成本的75%，主要是与HVAC有关的运行成本。其他成本，如更衣、厂房设施布局、环境监测方面也节省了花费。

按照2014年增补版征求稿的《中国药典》，无菌检查在B级背景下的A级设计的实验室，如图一所示，需要设计复杂的更衣区域，缓冲间。

图一 传统的微生物实验室布局图

而如果是用隔离器的情况下，最简单的设计就是一个D级房间，带一个物料进出口，一个人员进出口即可。如下图所示。

图二 无菌检查隔离器实验室部件图

2 无菌检查隔离器

2.1无菌检查隔离器的设计

无菌检查隔离器(如图三)一般结构由一个传递窗和一个操作区主箱体组成。结构使用不锈钢制成。隔离器具有良好的密闭性，运行时内部正压控制，内部单向流设计。主箱体上配备有手套，用以在隔离器中执行无菌检查操作。

主箱体内部设置有无菌检查专用的集菌仪，应当选用针对隔离器专门设计的集菌仪，如Millipore的Steritest^TM  Equinox Isofit Pump(见图四)。

图三 无菌检查隔离器

图四 隔离器专用集菌仪

传递窗和主箱体配备内置式汽化过氧化氢灭菌系统，根据工艺需求对隔离器内部或传递进入的耗材、样品和试剂容器表面进行灭菌。

隔离器可集成粒子计数器、微生物采样器等环境监测设备。

通过触摸屏对隔离器进行操作，根据客户需求不同可提供灭菌数据、环境监测数据报表的存储、电子版本输出或打印等功能。控制系统的设计可满足GAMP5，以及21CFR Part 11对电子记录和电子签名的要求。

2.2 汽化过氧化氢灭菌

汽化过氧化氢灭菌是无菌检查隔离器中最重要的功能之一，使得隔离器内部控制在一个生物负载很低的环境下。合理的灭菌循环可以使整个灭菌循环快速和安全。

由内部气流循环系统将快速生成的汽化过氧化氢带入隔离器主箱体和传递窗中，对试剂样品，耗材外包装表面进行灭菌。在隔离器完成空载的灭菌性能确认后，需要针对固定的试剂、耗材等物品的排放方式进行满载的灭菌循环开发并验证，图五是隔离器在进行满载测试。合理的物品排放，恰当的灭菌循环工艺参数，能在较短的时间内(视装载量和隔离器空间大小而定，一般在1.5~2.5小时左右)实现6 SLR。并且灭菌过程能具有重演性。图六为隔离器在空载时的灭菌循环曲线。

汽化过氧化氢灭菌工艺中很重要的一点是通风后过氧化氢的残留，一般要求通风后过氧化氢浓度< 1 ppm。过多的残留可能会导致假阴性的产生。

图五 隔离器满载测试

图六 隔离器灭菌曲线报表

2.3有关工艺耗材、试剂和工具

图七 传统的无菌检查隔离器

图七所示为传统的无菌检查，操作人员正用注射器在酒精灯的火焰保护下处理粉针剂样品。而试剂、培养基等是用牛皮纸覆盖用线扎的。而这样的传统操作方式，以及选用的耗材包装在隔离器中是绝对不推荐的。

操作者通过隔离器的手套对无菌检查进行操作，在使用前后都要对手套的完整性进行检查，在隔离器中应当避免使用注射器这类尖锐物，同时进行的操作又较精细复杂的工具。一是戴手套操作会使得手的灵活性相对降低，复杂的动作容易造成动作失误，而尖锐物容易扎破手套，破坏隔离器的完整性。

所有传入隔离器的物品使用汽化过氧化氢进行表面灭菌，要确保表面灭菌效果的同时，还要考虑过氧化氢在包装表面造成的渗透和吸附问题。包装材料的渗透可能会造成一定的工艺影响，例如，用于环境检测的培养基，如果过氧化氢渗透到培养基中，可能会造成检测结果的假阴性。而材料吸附会延长过氧化氢的分解，延长灭菌后的通风时间。因此需要对选用的包装材料进行一些评估，或者选用隔离器专用的成品耗材，如Merck Millipore，BD的相关产品。

2.4无菌检查隔离器的排产

以下为一个仅含主箱体的隔离器(不带Passbox)的一天的使用周期，适合测试量较小的用户使用。如图五，即为这种应用方式。

编号测试步骤时间(min)

1准备试剂、样品，打开隔离器15

2按照SOP进料30

3隔离器关门检查5

4隔离器泄漏测试，灭菌循环启动120

5整理内部物料15

6无菌检查正式进行(约10个批次测试左右)300

7打开隔离器进行清理，清洁30

总时间约8.5小时

当用户检测批次较多时，建议配置Passbox，从而可以连续得进行无菌检查。在进行无菌检查的同时，可利用Passbox进行下一批物料的灭菌，完成后转移至主箱体。图八所示即为带Passbox的隔离器，图中操作人员正在对隔离器的主箱体和Passbox进料。

首次灭菌完成后，主箱体就不再打开，而传递、进料和灭菌的操作都将在Passbox中进行，实现连续的测试。一天8.5小时左右可以连续做约20个测试。

图八 正在对隔离器进行装料

需要注意的是，当主箱体连续进行测试时，需要定期进行微生物检测，尤其注意隔离器手套手指部分要定期进行表面微生物测试，如果当微生物水平有超过警告线的趋势时，就应当对隔离器主箱体进行灭菌。通过这些微生物测试数据，可确定隔离器整体灭菌的周期，形成SOP。

2.5软墙隔离器

最早的无菌检查隔离器是软墙隔离器。它由不锈钢材质作为框架和基座，在框架上装上封闭的PVC材质的塑料罩，装配有半身衣或手套对无菌检查进行操作，透明的材质使得工艺内部的操作一览无余。相对于不锈钢的硬墙材质，这种软墙隔离器较为经济。由于PVC材料可折叠，框架可拆散，因此对于进厂空间有限制的实验室可能是一种可选方案。

但是软墙隔离器的结构不如硬墙的坚固，容易造成破损。对柔软的表面擦拭清洁也不如硬墙结构的操作可靠方便。在进行汽化过氧化氢灭菌的过程中，PVC材质容易吸附过氧化氢，从而造成通风时间过长。一般软墙隔离器中气流为紊流，虽然法规如USP对无菌检查隔离器的气流要求的描述为“紊流或单向流”，事实上，也来越多的用户倾向于使用单向流。图九所示的为一家无菌检查隔离器供应商对软墙隔离器和硬墙隔离器(带passbox和不含passbox)进行的趋势分析。可见无菌检查隔离器的需求量逐年增大，而软墙隔离器的使用量逐年呈递减趋势。

图九 无菌检查隔离器的发展趋势

3 总结

综上，无菌检查隔离器的应用能保障无菌检查在一个受控的封闭的，低生物负载的环境下操作，隔离操作者和工艺，从工艺本身避免假阳性的产生。当操作高活性、药性强的药品时还能保护操作者不受药物影响。按照国际主流的法规，无菌检查可以完全摒弃洁净室，缩小厂房结构，省去繁复的更衣过程，以及减少或者省略日常的房间微生物检测，降低运行成本。

隔离器的结构一定程度上限制了操作者的动作幅度，隔离器的手套也降低了手指的灵活性。一天的工作安排要充分考虑耗材、试剂的传递灭菌周期。手套、半身衣等部件的破损会直接影响隔离器的完整性。因此要重新考虑无菌检查工艺过程与隔离器的匹配性。使用适当的方法，和选择适合隔离器的耗材与工具是非常重要的。

无菌检查隔离器的装载量要经过验证，在保证灭菌效果达到6 log的同时，确保通风充分，残留降低到可接受范围，避免假阴性的产生。

连续进行多批次的无菌检查操作时，要关注隔离器内部的环境监测，包括粒子、微生物，尤其是工作台、手套等部件的表面微生物检查。制定合理的隔离器内部清洁和灭菌频率。

无菌检查隔离器发展至今已经超过了40年，有数据统计，在2000年，全球范围有500台无菌检查隔离器应用于大大小小的药厂。对于中国，无论从法规角度还是制药企业自身的发展来看，隔离器已经成为无菌检查的应用趋势。

参考文献

[1] 中国药典, 附录XI H 无菌检查法, 2010

[2] USP 24, Chapter<1208> Sterility Testing: Validation of Isolator Systems , second supplement (1999)

[3] PIC/S, PI 012-3, Recommendation on Sterility Testing, 2007

[4] PIC/S, PI 014-3, Recommendation Isolators Used for Aseptic Processing and Sterility Testing, 2007

[5] Patrice Cloue, Carmen M.Wagner, Sterility Test Isolators, 2009

[6] Jack Lysfjord, Practical Aseptic Processing –Fill and Finish, 2009, vol 2, 86-87

Abstract: As the change and update of the China GMP and Pharmacopeia, the requirement of the aseptic process and sterility testing is higher and higher. And the Isolation technology is widely used in pharmaceutical in China. More and more attentions are paid to Sterility Testing Isolator by the pharmaceutical industry. Although the sterility testing has the limitation itself, but it still will be the regulatory required test for release the sterile products. In this paper, the related regulations in the world are introduced. And advantages of apply isolator technology to sterility testing, structure and distinguishing features are also listed.

Keywords: Sterility Testing Isolator vaporized hydrogen peroxide false positive

作者简介

吴文蕾 (1982)硕士，技术部经理，主要从事隔离器在无菌制剂生产中的应用、验证等研究