2015年12月中国药典首次以指导性文件形式专门对隔离器的验证要求进行说明——本文通过对无菌检查隔离器的实际应用，提出了无菌检查隔离器的设备要求，并在隔离器的使用要求上出了看法和意见。

2015年12月正式实施的中国药典四部中，新增了通则9206-无菌检查用隔离系统验证指导原则，这是中国药典首次以指导性文件形式专门对隔离器的验证要求进行说明，该文件以美国药典为参考，结合了国内当前技术条件，详述了无菌检查隔离器的相关验证要求。无菌检查隔离器能有效降低无菌检查中发生假阳性的概率，同时由于其可以放置在中国药典中推荐的D 级环境，降低了对QC 实验室环境控制的要求，简化了人员更衣等程序。无菌检查隔离器以其可控的、先进的、低能耗的优势，在QC无菌检查实验室中越来越得到关注。

然而，国内用户对无菌检查隔离器的理解程度不一，国内设备厂家的技术与产品质量也参差不齐。目前业内无相对明确统一的技术标准和应用指南，这为无菌检查测试本身带来了很多隐患。另一方面，国内多数用户对隔离器使用也存在许多误区，这为我们国家药品质量控制带来了很大的隐患。本文通过对无菌检查隔离器的实际应用，提出了无菌检查隔离器的设备要求，并在隔离器的使用要求上出了看法和意见。

无菌检查隔离器的发展阶段

早在20世纪80年代以来，隔离技术在世界范围内已经得到了广泛的应用，而作为制药行业内最早引入隔离技术的实验室无菌检查行业，在国际市场上已经经历了数代变更。

第一代：以PVC等软性材料作为主体结构材料，空气处理系统设计为紊流结构;操作部件以手套/袖套组件、半身服为主，并以臭氧或过氧乙酸等消毒方式对控制微生物的主流手段。

第二代：随着对无菌隔离技术和灭菌技术的发展，隔离器发展为以不锈钢材料为主体结构材料，但结构上仍然保留了舱体内紊流设计。灭菌方式以连接外置的汽化或喷雾的过氧化氢设备为主。

第三代：为加强无菌检查隔离器使用过程中的风险控制和基于操作人员职业健康方面的考虑，隔离器发展为以不锈钢为主体材料，单向流设计，集成在线环境监测装置，汽化过氧化氢灭菌系统与隔离器集成。具备符合21CFR Part11的电子签名和电子记录要求，实现记录的灾难恢复、审计追踪等数据完整性的法规要求。

无菌检查隔离器技术要求

隔离器的材质

无菌检查隔离器目前国内市场最常见的有两种材质的隔离器，一种是以不锈钢、钢化玻璃为主要材料的“硬舱体”隔离器;另一种是PVC膜为舱体结构的“软舱体”隔离器。与硬墙式隔离器相比，PVC作为主体材料设计制造的软舱体隔离器存在以下的优缺点，如表1所示。使用PVC材料作为主体结构的软舱体隔离器时，应重点考量隔离器残留汽化过氧化氢对无菌检查过程的影响。

气流形式

虽然法规中没有明确要求无菌检查隔离器中气流的要求，单向流隔离器能维持动态下的A级，进一步提高无菌检查工艺操作的可靠性，避免假阳性的产生。相对于紊流设计，单向流隔离器气流均匀分布，灭菌气体分布扩散均匀。另外，在排残过程中，汽化过氧化氢残留浓度相对紊流设计隔离器更为均一稳定，便于测试，更具代表性。

当选用紊流隔离器时，应测试隔离器的换气次数和自净时间，一方面确保设备在使用前能以较快的速度达到静态下的A级，另一方面保证汽化过氧化氢的在灭菌后的通风效果满足要求。

不同的进排风口位置，不同的风量大小/换气次数，都会影响内部气流。因此对紊流隔离器需要进行气流流型测试来确认气流死角。这些气流死角可能并不会对灭菌效果产生影响，但是对隔离器使用过程中微生物的控制产生盲区，如图1所示。

隔离器的人机工程学设计

无菌检查操作通常在4~5h或者更长时间，因此合理的人体工程学设计能有效减轻操作者的长时间操作的疲劳及操作的便利性。

无菌检查隔离器制造商应对标准规格的隔离器进行人体工程学设计，从设备高度、手套/袖套组件的位置、操作平台高度、操作视窗尺寸，集菌仪与手套口相对位置等多个因素考量，保证其适应国内多数操作人员的需求。图2说明了在人体工程学上相应的尺寸要求。

由于无菌检查隔离器自身结构的原因，隔离器内部应设置有相应的辅助工具来弥补隔离器内相对受限的操作空间，保证无菌检查操作的便利性。

无菌检查隔离器的人机工程学设计应满足如下几点：(1)穿戴无菌检查隔离器的手套/袖套组件或半身衣能接触到或充分利用隔离器中的工具进行无菌检查操作;(2)无菌检查过程中，没有对手套产生过分拉伸，并手套应接触最少的表面;(3)无菌检查过程中，操作者不会产生局部肌肉长时间用力;(4) 无菌检查过程中，操作者的操作视野不受阻挡，能在自然状态下观察到关键工艺位置;(5)对于标准的无菌检查隔离器，能适应较广范围的人群操作。一般对于定制化的隔离器，应执行MOCK-UP模拟操作过程。

汽化过氧化氢灭菌

汽化过氧化氢灭菌是隔离器最常用的表面灭菌的方式，根据PDA TR51，提到过氧化氢灭菌循环开发验证过程中的关键影响因素有：灭菌前的隔离器舱体的温湿度，过氧化氢溶液的浓度，过氧化氢的蒸发效率，总蒸发的过氧汽化量，过氧汽化其他进入待灭菌舱体的温度，过氧化氢在舱体中的分布以及舱体中物品的摆放。因此至少应该对过氧汽化的用量，蒸发温度，灭菌前温湿度，舱体中的物品摆放进行控制。确保灭菌效果的可重演性。

隔离器的应用要求

背景环境

就法规的角度而言，9206无菌检查用隔离系统验证指导原则中提到：“建议不低于我国现行GMP中D级空气洁净度要求，……”而国外主流法规，PIC/S，USP等均不要求无菌检查隔离器的背景环境级别，仅要求对进入的人员进行控制。

从风险分析的角度考虑，背景洁净度越高，在物品传递过程中背景环境的物品表面的生物负载也更低，则发生污染风险的概率就相对更低。但一般在隔离器物品传递进入隔离器前，都会对物品表面进行擦拭消毒，在隔离器内会进行汽化过氧化氢灭菌。经过验证的灭菌过程都能够下降超过6log的对数值。使用隔离器进行测试时也始终保持隔离器的密封，不会受到来自于背景环境的影响。

物品的摆放

在隔离器的选用中，如何选择与自身测试批量相匹配的容积的隔离器很重要。用户应首先明确列举每日的测试量所用供试品的数量、包装、尺寸规格，以及培养基、缓冲液的数量包装和尺寸规格。并考虑日常工作排班情况选择合适的隔离器容积，确保隔离器能装载相应的物料。照经过验证的装载方式放入隔离器中。一般针对不同的供试品包装应设计相应的框架进行放置。物料之间不能紧贴在一起，避免灭菌死角。如下图所示为装载后的隔离器腔体。一旦经过验证，各种物品的摆放位置与摆放形式就应该固定，并且写入SOP。

隔离器的清洁

隔离器在使用前应进行清洁和消毒。通常使用不脱落纤维的抹布以酒精或者异丙醇润湿后进行擦拭。清洁的顺序是从高到低，从相对清洁的区域到相对脏的区域，从干燥的区域到湿的区域。每次擦拭使用抹布的清洁面，擦拭的路径有一定重叠。不能以圆周方式进行清洁。

手套除了要进行完整性测试外，还要对手套进行清洁和消毒。可以用抹布用消毒剂润湿后对手套表面进行擦拭，从手的部分向袖套部分的方向擦拭，使用手套时也可用消毒剂喷洒在手掌，然后搓揉手套的手指部分表面，直到消毒剂干燥。隔离器的清洁的方法、使用的清洁剂或消毒剂，清洁的频率应形成标准程序。

汽化过氧化氢灭菌

在实际应用中，灭菌验证要考虑的有以下3个方面：(1)灭菌效果以及其重演性：实验室的温湿度虽然没有特殊要求，一般满足操作人员的舒适即可;但必须保证实验室的温湿度条件不受季节气候因素而有大幅的波动;(2)包装完整性：隔离器在风险分析中除了考虑假阳性的风险外，还要评估假阴性的风险。假阳性的发生除了考虑产品本身抑菌成分影响外，还可能源于不当的表面消毒和灭菌。在塑料或其他有渗透风险的包装方式，在经过表面灭菌的过程中，过氧化氢的渗透会提高微量微生物的无法检出的风险。因此对这类包装需要进行包装完整性测试;(3)残留的过氧化氢：另外，过氧化氢灭菌循环结束后，隔离器腔体中残留过高的过氧化氢浓度，同样可能导致假阴性，也会影响环境微生物培养基的恢复生长性能。无菌检查隔离器内部应设置有低浓度的汽化过氧化氢浓度传感器或其他适当的检测手段，对排残结束后隔离器内部的汽化过氧化氢残留浓度进行实时监控或测试。为保证操作人员的健康安全，实验室空间中过氧化氢残留浓度应不高于1ppm。

隔离器手套

手套完整性测试：无菌检查隔离器手套应在使用前及无菌检查完成后进行完整性检测。手套的检查方法有两种，目测是最简单，也最有效的测试方法。一般将手套最容易损坏的部位进行适当的拉伸，检查是否有明显破损。同时检查手套是否有龟裂、老化现象。一般在使用前后进行检查，也可过程中进行检查。用手套检漏仪检查手套完整性，利用保压法来对手套进行检查。一般要求定期检查。无论使用何种方式检查手套，都需要对测试结果进行记录。

手套的清洁消毒：使用手套在无菌操作前，需要对手套进行清洁和适当的消毒。使用无尘抹布蘸取适量的消毒酒精，IPA或其他要求的消毒液对手套暴露在隔离器一侧的表面进行擦拭。擦拭的方向应该从手指向着手掌和袖套方向单向擦拭。每擦一次，应将抹布翻一面没使用过的表面再进行擦拭。

必要时，在操作前，穿戴好隔离器手套，用IPA或酒精直接喷到手的部分，然后像洗手一样搓手掌、手背以及交叉双手的手指，搓洗两指间的部位。用户应根据自身的工艺特点，明确手套清洁消毒的SOP，严格按照SOP进行操作。

隔离器的手套不能随意接触隔离器内部的任意表面，例如应该避免接触关键无菌表面，密封圈等灭菌风险点，以及容易对手套表面造成磨损或破坏的物体或表面。必要时可以在戴好隔离器的手套后，再戴一层无菌手套进行某些工艺操作。

隔离器的手套可随隔离器腔体内部一起用汽化过氧化氢进行灭菌。在灭菌过程中，要使用手套支撑架将手套最大程度的撑开，使得手套的表面(主要手的部分)能够暴露在灭菌蒸汽中。

环境检测

隔离器中应对沉降菌，浮游菌和关键表面的微生物进行检测。环境微生物检测应该在SOP中明确以下问题：(1)浮游菌采样量，以及采样;(2)沉降菌的采样位置，每块培养皿的暴露时间;(3)表面微生物取样位置确定，在测试过程中取样，还是在测试结束后取样。用接触碟取样还是用拭子进行取样;(4)建立微生物的警告限和行动限，以及采取的措施和原因结果的排查;(5)对表面取样后，接触过培养基的表面如何处理。(6)对于隔离器上的管道，废液管道、环境监测系统管道的微生物控制需要建立。

隔离器内的无菌操作规范

隔离器内部的操作人须遵守最基本的无菌操作。在隔离器中还需针对隔离器的特点注意以下问题：(1)隔离器中的所有动作都不能幅度过大或动作过快。如快速的在隔离器中挥动手套，会造成隔离器内部压力的巨大波动。快速的将手从隔离器手套中抽走会引起隔离器内部瞬时的负压;(2)手套不能接触任何与工艺操作无关的表面;(3)必须由微生物专业并经过隔离器操作培训合格的人员操作无菌检查隔离器。

总结

本文从隔离器的结构设计、隔离器的操作使用等方面提出了意见和说明。应该基于无菌检查工艺需求，风险的角度，法规的要求等多方面对隔离器的设备功能和性能进行要求与规范。同时，隔离器不仅仅是一个工艺设备，而是与无菌检查相结合的一种工艺。因此在进行无菌检查工艺验证时，需要将隔离器的因素进行充分考虑。

本文作者系上海东富龙爱瑞思科技有限公司职员。