本文以方法验证和专用线的清洁验证为例，讨论如何应用流程分析的方法执行风险分析，进而确定验证需求。

验证之前，应当分析验证对象的风险，进而确定验证需求。笔者在咨询工作中，发现很多验证人员是在死记硬背指南中的验证要求，或者道听途说，不能根据实际情况确定验证需求。主要的原因，是缺少风险分析的方法。

本文以方法验证和专用线清洁验证为例，示范如何应用流程分析的方法进行风险分析，并确定验证需求。

方法验证的设计

检测方法的可靠性，在于测量值与真实值一致，即“误差”得到有效控制，这是方法验证的目的。在方法验证中，随机误差通过中间精密度进行评估，系统误差通过其他验证项目进行评估。

下面以一个检测方法为例（杂质B的检测），分析以下情况的验证需求：

（1）初次验证；

（2）药典方法确认（确认药典方法对于某个来源样品的适用性，以及检测实验室能否满足检测要求）；

（3）方法转移（将已经验证的方法，从一个实验室转移到另外一个实验室。方法转移中，样品来源相同，我们假设转出方实验室已经进行了完整的初次验证）。

该检测方法的流程描述见图1，验证需求的风险分析过程见下页，分析结论见表1。

样品贮存步骤

风险1：如果样品有温度要求，或者有稳定性方面的问题，那么贮存时间的增加，是否会造成杂质B的含量变化，或者造成物理状态改变而难以检测？

制备样品溶液步骤

风险2：如果有提取过程，是否会吸附杂质B或者造成其降解？

风险3：提取条件的细微变化（实验室内可能的变化，如pH和提取时间的细微变化），是否会对提取过程造成影响？

风险4：过滤过程是否会吸附杂质B，或者引入可能干扰检测的杂质？

风险5：样品溶液和标准品溶液是否有稳定性的问题？如果发生OOS，原溶液多长时间内是有效的？

物质分离

风险6：A、B、C是否能完全分开？

风险7：A和C的存在，有没有可能影响B的分离？

风险8：色谱柱的不同品牌、色谱柱的使用寿命，是否会影响分离过程的效果？

风险9：分离过程条件的细微变化（实验室内可能的变化，如pH和柱温的细微变化），是否会对分离过程造成影响？

风险10：样品是否有可能残留在HPLC系统内，对后面样品检测造成影响？

风险11：分离过程是否稳定，同样条件下，每次都能得到一致的结果？

获取图谱

风险12：波长选择是否能够保证在杂质B紫外吸收的波峰或者平坦处进行检测？

风险13：溶剂峰是否干扰杂质B的峰？运行时间是否够长，保证杂质B的检出？

读取原始数据

风险14：基线噪音的存在，会在多大程度上影响检测能力？

计算

风险15：物质浓度与信号响应值存在函数关系。哪一段函数关系，最方便操作？

风险16：上述线性浓度范围，能否同时保证溶液配制过程和分离过程正常工作？

风险17：对上述系统误差的来源进行控制后，在实验室正常变动范围内（不同仪器、不同人员、不同批次溶液、不同天），是否每次都能得到一致的结果？

专用产品线的清洁验证

清洁的目的是除去污染。清洁验证不仅要证明清洁方法可以去除污染物，而且要证明，清洁方法本身不会带来污染。

专用线指只生产一个产品，或者同一产品不同规格，或者共用线上同一产品生产的连续生产。

风险1：正常生产中，有可能生产后无法立即清洁（例如等到下一个班）。那么在等待的这段时间内，待清洁的物质有没有可能降解成其他物质，或者有没有可能随着水分的蒸发，清洁变得更加困难。

验证需求：最迟清洁时间

风险2：清洁剂在清洁条件下（例如一定温度和时间），是否会造成待清洁物的降解。如果降解的话，降解物是否被有效除去。

如果清洁后设备不烘干，或者有些部分不能烘干，那么清洁剂的残留与待清洁物长期接触（例如清洁有效期内），是否会形成其他杂质。如果形成杂质，那么需要评估目前清洁方法或者清洁有效期的适当性。

验证需求：待清洁物的降解可能性（这个研究通常通过小试完成）

风险3：清洁剂是否会造成残留，残留量是否足以构成污染。

验证需求：清洁剂的残留

风险4：虽然是专用线，上一批物质A的残留通常不认为是对下一批物质A的污染。但是从批次完整性考虑，还是应当控制残留量。

验证需求：待清洁物的残留量

专用线的残留量限度是没有法规指南的；欧美国家法规检查员在这一方面的意见也不统一，有的可以接受目视清洁作为残留限度，而有的坚持要检测结果（因为“目视清洁”受人员影响太大）。通常我给客户的建议是每个生产步骤不超过下批批量0.1%的残留限度。

从这个角度而言，清洁剂是否能够溶解待清洁物，对于清洁过程并不是关键问题。清洁过程并不是简单的先溶解、后冲洗，而是一个复杂的物理过程；我见过使用不溶解残留物的清洁剂，最后检测残留限度仍然合格的情况。另外，某些残留物溶解后会降解，反而会造成更大的污染风险。因此，在选择清洁方法的时候，最好进行一个小试，将大量残留物喷洒到模拟的设备表面，然后使用清洁方法清洗，观察残留是否降到限度以下。这是清洁方法开发和风险分析的重要步骤。

风险5：清洁后，设备有可能受到污染，尤其是微生物污染。

验证需求：清洁有效期

通常通过清洁后和清洁有效期结束后的微生物水平比较，进行评估。

笔者不建议客户做微生物回收率。由于微生物本身的活动特性，清洁验证取样方法的微生物回收率变异太大。我们得到微生物检测数据，看的是趋势，并结合生产条件，进行微生物污染产品的风险分析。

结论

上面分析过程得出的验证需求，与法规指南的要求是一致的[1, 2, 3, 4]。
掌握这种分析方法，可以帮助理解法规指南为什么有这样的验证要求，更好地理解和控制验证对象的变异来源，节省宝贵的验证资源。上述风险分析过程的记录，不仅是良好的培训资料，而且在法规检查过程中，会给检查员留下深刻印象，有利于获得良好的检查结果。

【参考文献】
[1] FDA - CDER, Reviewer Guidance - Validation of Chromatographic Methods，1994。
[2] PA/PH/OMCL (05) 47 DEF, Validation of Analytical Procedures, 2005。
[3] USP36-NF31, General Chapter <1226>, Verification of Compendial Procedures, 2013。
[4] USP36-NF31, General Chapter <1224>, Transfer of Analytical Procedures, 2013。

备注

“缺乏信息”：药典方法没有提供信息。

“实验室条件”：该项目受到实验室实际条件的影响，例如人员操作、设备性能和色谱柱性能等等。

“样品来源”：不同来源的样品可能含有不同的杂质或者辅料，可能会对检测方法造成影响。

“样品特性”：该项目由样品特性决定。只要样品特性不变，该项目就不受影响。

“方法特性”：该项目由方法特性决定。