无菌生产工艺是无菌原料药制备过程中难度最大的工艺验证之一，由于许多原料药无法最终灭菌，原料药在进行过滤、干燥、粉碎、分装等操作过程中就必须尽可能地避免被微生物污染。影响产品是否无菌的因素相当多，如生产的设计及其设备布局、生产环境状况、所有与生产相关的设备及物料的污染状况、人员操作和卫生状况等，每一个环节对最终产品的质量都举足轻重。为了确保无菌生产工艺系统无菌的可靠性和适应性，将需要通过一系列的验证来确保产品的无菌性。

无菌工艺验证需要解决很多问题，如模拟介质的选择、无菌工艺验证的相关要求、设备的灭菌、如何达到全培养的目的、达到无菌的组织保证以及最终结果分析等，任何一项问题没有处理好，都会对最终结果造成影响。

1模拟介质的选择

无菌原料药对模拟介质的选择很关键，选择的模拟介质应有如下特征：

(1) 没有抑菌作用。若模拟介质有抑菌作用，将会对生产系统中的细菌生长产生抑制作用，以至于不能培养出细菌，产生假的结果。模拟介质最好具有促进细菌生长的作用。如果选择对细菌生长有促进作用的固体培养介质做验证，对生产环境的保护则特别重要。因为，如果有些操作是使介质暴露的，介质的尘粒会飘散到某些较难清洗的地方，如空调系统的送风口和回风口附近，给细菌在该处的滋生创造了条件，所以应有措施保护不易清洗的死角不被介质污染。

(2)模拟介质还应有较好的溶解度。因为若溶解性能不好，悬浮在培养基中的模拟介质使培养基发生混浊，影响结果的判断。

(3)模拟介质加入培养基后，不应影响培养基的质量，pH不发生大的变化，以适应大多数细菌的生长。

(4)对设备没有腐蚀性，对人体无害，对环境不发生污染。

选择模拟介质，需要根据各公司的具体情况而定，目前多数厂家采用培养基灌装试验来证明其无菌工艺的可靠性。所用的培养基应有较好的溶解性，营养程度要高，能够满足多种微生物的生长。一般通过生长促进试验验证。如生产工艺是在厌氧条件下，选用的培养基应能够使厌氧微生物生长。

2无菌工艺验证的相关要求

2.1验证前的准备

2.1.1生产设施的设计和确认

生产设施的设计应能使潜在的污染降低到最小。例如，生产设施应易于清洁和消毒、产品或物料敞开之处的空气要有一定的质量要求、温度和湿度的控制要适宜、穿着无菌衣的操作人员感到舒适、能防止污染和交叉污染等等。应重视设计上的细节，减少污染源，以确保无菌生产得以实施。无菌工艺验证是执行难度较大的验证之一，参与者应充分意识到设施的设计和确认，其是验证成功的主要因素。

2.1.2公用工程的确认

影响产品质量的公用工程(如蒸汽、压缩空气、加热、制冷、水系统等)都应经过确认。公用工程是生产得以正常实施的保证之一，若其中任何一个系统出现故障，将会使产品发生潜在的或严重的污染。应有公用工程的维护计划并按计划执行，目的就是不让系统发生故障，保证生产的顺利进行，而不是发生故障后去修理，经常发生故障而被维修的公用工程是不能保证无菌生产的。

2.1.3设备和工艺确认

验证实施之前，所有的设备、无菌环境、计算机控制系统以及生产工艺都应经过验证。产品暴露是发生污染使无菌工艺验证失败的主要原因之一，为防止或降低污染发生的几率，给暴露产品提供层流空气的百级层流罩或隔离器是非常重要的，同样被灭菌过的物品由灭菌器到生产线的传递和经由必要的手工操作进入生产线前的保护也是至关重要的，应尽量避免人员对设备或物料接触的操作。这些都应经过验证。

2.1.4设备的清洗和灭菌

在无菌工艺验证之前接触模拟介质的设备表面应清洗灭菌，并防止灭菌后的再污染。若生产的药品具有抗菌性或者杀菌性，这种清洗尤为重要，要确认清洗后对微生物没有抑菌性，或可以有效的消除抑菌性。若清洗或灭菌不彻底，残存的药品会使模拟介质受到污染或设备表面的微生物使模拟介质染菌而使验证失败。这种清洗和灭菌过程应经过验证，以保证清洗彻底和灭菌成功。

设备灭菌是无菌工艺验证的关键的一环，所有与工艺相关的设备都必须灭菌，首先设备的灭菌要通过灭菌验证，包括最冷点的确定、温度分布和热穿透、生物指示剂的挑战，最终确定灭菌的温度、时间和排气点。所用的生物指示剂应确认其类型、来源、菌种的浓度和D值。

3无菌工艺验证的组织保障

为了保证无菌工艺验证的顺利执行，成立无菌工艺验证执行小组，目的是：(1)为验证工作提供人、财、物支持;(2)最终决定验证期间发生各种事务的处理;(3)批准验证方案和计划及验证报告;(4)分别负责各子小组的工作。

无菌工艺验证执行团队分组如表1所示。

表1无菌工艺验证执行团队分组

序号 组别 序号 组别

1 验证流程实现组 9 设备试压、泄漏测试及公用支持系统保证

2 现场环境、人员卫生检查组 10 摄像及现场记录组

3 设备灭菌效果确认保证组 11 设备清洗效果保证组

4 过滤器完整性检查组 12 操作现场指导

5 各种物品包括培养基物料准备 13 样品培养组

6 验证时间节点的控制 14 洁净区内设施无菌性保证组

7 仪表准确性保证组 15 后勤保障组

8 环境监控、现场取样 16 安全保障组

要求：各组的检查情况均需要进行书面确认并将记录留档;各组及全体人员发现异常情况均需要及时上报;全体组长在验证期间全程值班。

4无菌工艺验证的过程

无菌工艺验证的设计，应充分体现QbD(质量源于设计)的理念，尽可能地与工艺过程符合，最大限度地保证产品的质量。

4.1标准操作规程的确认以及人员培训

标准操作规程(SOP)是指导操作人员进行某项操作的书面程序，是操作人员的操作标准，是生产操作成功的关键。标准操作规程应能对操作人员提供足够的指导以完成本项操作。

标准操作规程应由技术人员编写，部门主管审阅，质量保证部主管批准。将批准后的标准操作规程对操作人员进行培训，使之真正理解并能熟练掌握。标准操作规程的原件及培训记录存放在资料管理部门，操作现场存放的是复印件。验证前应确认每一项操作有标准可依，以免造成管理上的漏洞，且确认这项操作已被培训过，同时操作人员已能熟练掌握。

验证之前应对所有的操作人员和质量管理人员培训与验证有关的各项操作(可根据验证方案和SOP)，以避免验证过程中有关人员不理解甚至不知道怎么做，保证验证的顺利实施。如果生产车间新增加或调换的无菌操作人员超过20%，应重新做无菌工艺验证，以保证无菌操作能顺利进行。

4.2仪表校正

仪表校正应由有资格的人员或单位按照公司批准过的SOP来进行，并符合国家可追踪的标准。仪表的校正频率至少符合国家规定，并根据使用频率调整并严于此标准。使用频率越高，仪表的磨损越厉害，校正频率就应越高。由于使用没有经过校正的仪表，所得的数据无效。

4.3工艺条件

无菌原料药的生产工艺具有其自己的特点：设备种类多、设备复杂、管路长，且不同的生产工艺有不同的特点，根据各自的特点选择固体或液体模拟介质。虽然，已尽量地减少设备的内部暴露和减少物料产品的暴露，但是不可避免地会有一些设备与外界环境相通，或是物料暴露在环境中，这些开口处应有呼吸器或百级层流空气的保护，更好的是使用隔离器保护。验证时，应有模拟这些物料暴露的操作。

有些生产工艺中具有结晶的操作，这使得模拟过程有些困难，因为结晶过程中有相变产生，应该考虑这种变化是否会影响到微生物的生长。最好的办法是选择两种模拟介质，它们在结晶过程发生反应生成另一种模拟介质。选择这样的介质可能会有很大困难，简单起见，也可用同一种液体模拟介质模拟结晶过程流经所有管路加到结晶罐中。若结晶过程有加晶种的操作，模拟过程中也应有这样的操作。晶种可用模拟介质代替。为使晶体粒度均匀，有些结晶过程有降温过程，在模拟过程中不应降温，因为微生物在低温下不易生长。

干燥过程中的温度一般会抑制微生物生长，甚至将微生物杀死，在模拟过程中应保持室温，以免温度太高杀死细菌而使验证失败。也有用冷冻干燥除去湿分的，模拟冻干参数的选择也不应使细菌的生长受到抑制。

总之，在验证过程中尽量使工艺参数和实际情况一致，但是为了使微生物生长良好，允许选择的工艺参数和实际情况不一致，但是这些参数不应和生产工艺产生重大差别。无菌原料药的分装剂量一般较大，在这种情况下分装过程中应减慢分装速度，以增加产品暴露的可能，在最差状况进行操作。

在进行验证时，应根据生产过程中曾经出现的异常情况或者可以预想的可能的异常情况设置最差条件，以考察生产过程中出现此异常情况时产品的无菌性质是否会受到影响。

4.4操作时限

在原料药的生产中，每一操作都应有操作时限来保证已灭菌的物品避免受到微生物的污染或产品降解。操作时限越长，产品受污染的几率越大。

在无菌工艺验证时，应将操作时限调整至最大，在最差状况下操作，如果这时验证结果可靠，那么在小于此时间下进行的操作当然也是可靠的。尤其是已灭菌物品由灭菌到使用时的保存时间更加重要。在验证时，应将已灭菌物品至少放置到规定的保存时间，这样的验证结果更具说服力。每一步操作都应延长甚至超过操作时限，这样会使得总的工艺时间很长，但是这样的验证结果更能保证正常生产时的无菌状态。

4.5环境监测

在验证过程中环境的质量至关重要，应在恶劣的环境下进行操作，但是不能恶劣到使产品发生染菌的程度。一般采用增加操作人员数量的办法恶化环境。应对环境进行监测以评价验证过程，所有暴露产品的操作都应同时监测本区域的环境。环境监测包括以下几个项目：无菌室的温度、湿度、尘埃粒子、沉降菌、浮游菌、人员和表面微生物。

沉降菌和浮游菌用培养皿进行测试，培养基为营养琼脂或其他适宜的培养基。培养皿应放置在微生物监测史上情况最差的部位。在验证过程中应增加取样的频率，并且应在分装区域放有2个以上的取样培养皿连续暴露取样，暴露时间应为分装的全过程，但不宜超过4h，否则营养琼脂变干而不能提供足够的营养使细菌不能长出。若工艺时间超出4h，应重新放置一个新的培养皿进行监测。营养琼脂在使用前应做微生物生长促进试验，以保证营养琼脂对微生物生长的适应性。

方法如下：选择合适数量的营养琼脂培养基(此数量具有统计学意义)，分别接种10-100CFU 的金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillusniger)和环境中的检出菌。细菌分别置于(32.5±2.5)℃的环境中培养不超过3天，真菌置于(22.5±2.5)℃的环境中，分别培养不超过5天。接种的微生物生长良好。测试浮游菌可以用缝隙—琼脂撞击采样法、离心采样法、液体撞击采样法及膜过滤法。一般说来，浮游菌比沉降菌更能反映环境的质量。表面微生物的测试可用擦拭法或Rodac碟。擦拭法用于非规则表面的微生物测试，用擦拭法测表面微生物之前应先测回收率。影响回收率的因素很多，包括微生物的种类和数量，不同的操作人员进行测试会得到不同的回收率，主要原因是擦拭时用力的大小，每个测试操作人员有自己的回收率数值。测试回收率时，不要选择生命脆弱的微生物，因为这些微生物被擦拭时会死去，产生不可信的结果。用Rodac碟测试规则表面的微生物污染程度比较方便，但是这种测试会有营养物质残留在被测试的表面，应清洗干净，否则这是一个很大的污染。尘埃粒子尽可能使用在线监测，取样点数和取样量符合现行的法规的要求，监测的结果应能证明在产品暴露的关键区域空气质量达到了100级洁净区的空气质量标准。

4.6工艺过程的模拟和全培养

由于一般原料药生产工艺都经过结晶过程，其间会发生相变，因此无菌工艺验证不可能完全按照原来的实际工艺来进行模拟。

从原材料配制起，以培养基作为模拟介质，经过除菌过滤、结晶、过滤、洗涤几个步骤后，为了保证所用的介质是全部用于无菌检验，需要对多余的模拟介质采取措施进行全量培养，以保证所用介质的完整性。以后的干燥、粉碎、分装步骤再按生产工艺进行。为了考察各步骤的无菌状况，要在各个阶段进行取样，模拟生产过程中的取样，不要刻意地增加取样点。取样的样品也要进行培养，以达到全面培养的目的。为了保证取样的无菌性，对取样口进行灭菌，如果不能使用蒸汽灭菌，可以使用杀孢子剂灭菌，但在取样前要保证杀孢子剂残留没有抑菌性。

生产过程中可能有升温、降温过程，此时应注意模拟介质对温度的敏感性。可通过实验室考察。

4.7样品培养

阴性对照：在验证过程中，随机取出有代表性的一定数量的装有培养基的包装容器作为阴性对照。

阳性对照：验证过程中，随机取出有代表性的一定数量的装有模拟介质的包装容器，1/3接种浓度为<100CFU的5种标准菌株和环境的检出菌，接种后细菌在(32.5±2.5)℃环境下培养48～72h，霉菌和酵母菌在(22.5±2.5)℃培养5天，接种包装容器中均有明显的所接种微生物的生长，以此作为阳性对照。

样品培养：将分装得到的产品在操作现场灌装培养基，然后密封，检查密封性。全部产品应在(22.5±2.5)℃和(32.5±2.5)℃分别培养7天，总培养14天，每天检查全部样品的微生物生长情况。若发现污染应注明批号、包装容器号，同时检查密封情况。若有破损注明原因。污染的样品应做微生物鉴别，鉴别到种。

5结果评价及再验证

在制剂中填充低于5000单元接受标准为0污染，但是在无菌原料药生产中，包装单位较大，得到的总分装容器数一般较小，这使得抽样测试和结果计算失去统计学意义，又因为生产批量是固定的，因此所有产品都应被培养，并且所有的阴性对照和阳性对照都必须合格。若阴性对照或阳性对照不合格，则无菌工艺验证失败需要重新做。若发现有一个容器长菌，就认为无菌生产工艺中有染菌的因素存在，应立即停产，调查产生污染的原因，采取措施后重新做验证。

新生产线在投产之前要做无菌工艺验证，验证通过后该生产线才能投入使用。正在运行的生产线应每年做2次无菌工艺验证，每个可能进入洁净区或与生产接触的人员每年至少参加一次无菌工艺验证。对于厂房经过大修、主要设备更换以及新建厂房等情况应进行至少连续3个周期的无菌工艺验证。如果是周期性的再验证，如果在该两次验证期间没有发生产品的染菌，可进行一个运行周期的验证就足够了;如果该验证通过，则证明该系统能够稳定地保持无菌性;如果该验证失败，应该详细地调查原因并消除隐患后，再重新进行至少连续3个周期的验证，只有所有验证全部通过，才能认为本无菌生产工艺是可靠的。

如果在两次验证期间发生过产品染菌情况，经过调查和细菌鉴别，确定染菌原因是由可以控制的因素造成，或染菌因素比较轻微，改正这些失误后可以继续进行生产;如果进行调查及细菌鉴别不能确认染菌原因，则应对无菌生产系统进行无菌工艺验证以确认哪些环节造成系统染菌，并对这期间生产的产品进行无菌风险的调查和评估。

6验证报告

验证完成之后应起草一份验证报告，对以上内容做一个简要总结，主要包括以下内容：验证题目、验证目的、参加验证部门和人员、人员的培训、采用的工艺参数和操作时限、选择的模拟介质和培养基、模拟过程中的中断、偏差及其调查、培养条件和最终结果，最终报告应由企业质量负责人批准。只有当最终结果合格并且最终报告经过批准后，企业的无菌原料药生产才能开始(或继续)进行。