在生物制药生产过程中，如果目标产物以胞外表达，通常会在细胞培养或发酵后进行澄清步骤。澄清过程中，粗细胞培养液或发酵液经过处理，去除不溶性固体、细胞、碎片和其他颗粒物，而目标胞外产物则保留在滤液中。可溶性杂质，例如宿主细胞蛋白（HCP），也可能被部分去除。历史上，澄清过程被认为对关键质量属性（CQA）的贡献有限。作为上游收获的一部分，许多生物制药公司尚未从工艺开发到生产都建立完善的质量控制策略，这使得质量源于设计（QbD）原则难以应用于该步骤。然而，随着上游和下游工艺（DSP）技术的进步，以及细胞数量和滴度的提高，有必要重新评估澄清作为影响药品质量的关键步骤的重要性。利用质量源于设计(QbD) 原则开展受控研究，以明确工艺流程并建立参数，可以提高对工艺杂质的控制，并有助于制定合理的质量控制策略，将质量融入工艺流程。本文介绍了一种基于 QbD 的系统方法，用于处理胞外产物的澄清工艺，其中杂质在澄清后的滤液中去除。文章重点阐述了如何运用 QbD 原则优化澄清单元操作，从而提高工艺效率和产品质量。

生物制药生产中的质量源于设计（QbD）理念

QbD的历史

质量源于设计（QbD）的概念起源于20世纪70年代初，由Joseph M. Juran博士提出。在其1992年出版的《质量手册》中，Juran博士概述了质量规划的原则，强调产品质量可以从两个主要方面来描述：“满足客户满意度的产品特性”和“无缺陷” 。

自 1970 年以来，众多专家一直致力于根据这一理论改进产品。在2014 年的一篇论文中，Jyotsna Balasaheb Jadhav简明扼要地阐述了这一概念：“质量源于设计是指在产品开发阶段设计和开发生产工艺，以持续确保最终产品达到预定的质量标准。”

在Jadhav发表上述言论之前，根据ICH Q8(R2)的定义，QbD（质量源于设计）是“一种系统化的开发方法，它从预先设定的目标出发，强调对产品和工艺的理解以及工艺控制，并以可靠的科学和质量风险管理为基础”。

监管机构对质量源于设计（QbD）概念的看法

美国食品药品监督管理局（FDA）于2003年建立了现行药品生产质量管理规范（cGMP）体系，并于2005年开始重点关注质量控制的风险评估。同样，欧洲药品管理局（EMA）也于2005年开始考虑采用cGMP，正如其题为“欧洲药品管理局2010年路线图：为未来奠定基础”的新闻稿中所述。在这些举措的推动下，人用药品注册技术要求国际协调理事会（ICH）于2005年开始发布药品研发和生产指南。自这些活动开展以来，质量源于设计（QbD）理念已被应用于药品领域，ICH指南也持续推荐通过QbD进行质量控制。

生物制药生产中的质量源于设计 (QbD) 理念

2009年，Rathore发表文章指出，尽管QbD在小分子药物生产中得到了更广泛的应用，例如在注射剂的结晶或冻干工艺中采用过程分析技术（PAT）理念，但生物制药领域关于QbD应用的文献仍然有限。Cook等人提出了一个案例研究，该研究利用实验设计方法，确定了单克隆抗体（mAb）纯化过程中疏水相互作用层析工艺的关键工艺参数及其目标值。最初，QbD应用于小分子仿制药的生产，但自2009年以来，生物制药行业越来越重视采用QbD原则。然而，QbD目前仍不是药品监管申报的强制性要求。

过去十年间，生物技术行业和监管机构，特别是美国食品药品监督管理局（FDA），为质量源于设计（QbD）的实施奠定了基础，克服了可能阻碍其成功的各种挑战。因此，QbD 工具和方法正日益融入全球制药企业的日常工作流程中。

生物制药领域质量源于设计（QbD）的演进标志着药物研发和生产的关键性转变，这一转变受到重要监管里程碑事件以及向更加结构化、科学驱动型战略转变的影响。自20世纪90年代末FDA调整监管重点并于1997年颁布《FDA现代化法案》以来，制药行业开启了新纪元。2002年推出的“21世纪药品现行良好生产规范（cGMP）”倡议进一步巩固了这一演进，随后发布的ICH Q8、Q10和Q11指南也对此进行了完善。这些进展为将QbD原则融入生物制药工艺奠定了基础，强调通过科学知识和风险管理来透彻理解产品和工艺设计的重要性，从而提高产品质量和生产效率。

单克隆抗体产品的质量源于设计 (QbD) 理念

自2009年以来，质量源于设计（QbD）理念已被应用于生物制药行业，最初由美国FDA和欧洲药品管理局（EMEA）等监管机构倡导，旨在提升现行药品生产质量管理规范（cGMP）。2009年至2021年间，单克隆抗体（mAb）产品的研发和获批数量持续增长，2009年约有10种抗体获批，而2021年则约有50种抗体获批。图1展示了生物制药市场份额报告中各类生物制药产品的市场趋势。从图1可以看出，单克隆抗体在所列生物制药产品类型中占据了很大比例。

图1. 生物制药市场，按产品类型划分

许多关于单克隆抗体的案例研究都集中在诸如缺乏主要或意外降解产物以及识别降解途径以指导控制策略等方面，突显了质量源于设计（QbD）原则的应用。

顺应这一趋势和不断发展的质量源于设计（QbD）理念，世界卫生组织于2022年4月发布了专门针对单克隆抗体（mAb）产品的指南。这些指南概述了其目的、范围和术语，重点强调：为涵盖mAb的上市许可提供监管指导和注意事项；涵盖所有同种型的mAb以及基于抗体框架的相关蛋白；此外，该指南还涵盖生产和质量控制以及对国家监管机构的指导。

QbD在生物制药领域的重要性

回顾单克隆抗体产品的质量源于设计（QbD）的历史和理念，不难发现QbD已深度融入行业，成为质量控制的关键要素，它将质量融入生产过程，而非仅仅在最终产品中进行质量检验。生物制药的质量直接影响患者安全，因此必须进行严格的质量控制。QbD理念提倡采用系统化的方法进行生产和工艺开发，这不仅对患者安全至关重要，对生产商也同样重要，它有助于实现安全高效的生产，并对生产过程进行有效的控制。

生物制药的一般纯化工艺和澄清策略

澄清概述

在生物制药工艺中，澄清是指上游细胞培养收获步骤，该步骤将粗细胞培养液或发酵液分离，以去除不溶性固体、细胞、细胞碎片和其他颗粒物，从而得到目标产品溶液。该步骤对于制备后续下游纯化工艺所需的原料至关重要。

澄清过程通常可采用多种单元操作，例如离心、过滤和/或沉淀，并辅以预处理（例如，盐、酸和聚合物）。为了获得足够澄清的进料流以进行下游纯化工艺，可采用一种或多种技术组合来实现高效的澄清（图 2）。这些方法有助于将固相组分与液相分离。生物制药行业近期的一个趋势是采用一次性深层过滤技术，该技术在成本效益、运行效率和加快产品开发方面具有战略优势。

图2. 上游生物制造工艺中一级和二级澄清步骤的选择方案

近年来，随着上游生物制药生产中细胞密度和产品滴度的提高以满足日益增长的需求，基于沉淀或絮凝的预处理方法作为有效去除颗粒状固体和可溶性杂质的替代技术，已被广泛研究，旨在减轻下游纯化步骤的负担。沉淀可以降低不需要的溶质的溶解度，从而形成固体颗粒；而絮凝剂则可以通过促进分散颗粒聚集形成更大的团簇来破坏生物胶体悬浮液的稳定性，从而增大平均粒径分布。由于预处理会导致粒径增大，大多数预处理方法建议与具有大孔径和大容量的深层过滤器配合使用。Singh等人比较了治疗性生物制剂澄清过程中常用的沉淀剂和絮凝剂（表 1（参见原文））。尽管作用机制会因所用化学品或聚合物的不同而有所差异，但这两种方法都能提高下游净化工艺的生产率和效率。预处理虽然是有效去除杂质的可靠方法，但仍存在一些实施方面的挑战。这些挑战包括成本效益、稳健性和工艺适用性，以及絮凝剂去除的验证和下游工艺后续清除的验证。在将絮凝和沉淀技术应用于澄清工艺之前，应考虑这些因素。

由于上游单克隆抗体（mAb）的滴度很高，Protein A和离子交换（IEX）层析填料的结合载量仍然有限，这给传统的纯化工艺去除其他杂质带来了巨大挑战。例如，生产规模的层析柱直径通常可达两米，将更大的层析柱引入现有的生物制药生产设施在技术和经济上都具有挑战性。因此，人们一直在寻求替代方法，包括借鉴生物制药领域其他行业的沉淀技术。通过调节pH值并在收获样品中添加絮凝剂，可以诱导杂质聚集，然后通过后续的过滤单元操作将其去除，而mAb产品则留在上清液中。该过程有助于澄清过程中的固液分离。酸和带电聚合物是常用的絮凝剂。

用酸调节pH值操作简便，无需复杂的分析方法即可检测残留物。然而，控制合适的pH值至关重要，因为它会影响目标产品的稳定性，尤其是在产品在低pH条件下稳定性较差的情况下。添加带电聚合物能有效诱导颗粒固体和可溶性杂质的聚集；然而，为了在不同的工艺规模下获得相同的絮凝效果，可能需要进行放大性研究。此外，可能需要复杂的分析方法来确保从工艺流体中完全去除聚合物。最后，在澄清过程中添加带电聚合物絮凝剂时，应仔细确定搅拌速度（rpm）和工艺持续时间等工艺参数。

抗体——经典单克隆抗体、双特异性抗体和抗体偶联药物

包括双特异性抗体（BsAbs）和抗体偶联药物（ADC）在内的单克隆抗体生物治疗药物在生物制药市场中占据了很大比例。

为了设计用于澄清单克隆抗体（mAb）产品的最佳方法，了解待收集细胞培养液的某些特性至关重要。本文描述了收集澄清过程中需要考虑的几个重要因素。首先，需要考虑上游细胞培养条件，例如细胞密度、活力、pH值和渗透压，这些因素会影响收集液的稳定性。这种稳定性决定了mAb产品的稳定性。其次，应考虑产品特性，例如等电点（pI）值和产品浓度（滴度）；最后，杂质谱也很重要，例如宿主细胞蛋白（HCP）、宿主细胞DNA（HCD）和聚集体（组成、浊度）。

Mi Jin等人利用二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）评估了中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养物中的宿主细胞蛋白（HCP）杂质谱。研究表明，HCP呈酸性（pI < 5–6），分子量 < 75 kDa。由于HCP在正常细胞培养条件下于中性pH范围内带负电荷，因此带正电荷的深层过滤器可在澄清过程中有效去除部分HCP。随着上游工艺中细胞密度的增加，近年来收获澄清策略的发展趋势是采用两步深层过滤。一级澄清主要利用粗滤器去除大量完整细胞和固体颗粒，而二级深层过滤器则去除更细小的杂质，例如胶体以及可溶性HCP和HCD。在某些情况下，还会使用微孔膜过滤器进行额外过滤，以减轻中间除菌过滤器和层析填料的负担。

澄清的重要性

从质量角度来看，澄清被认为是生物制药生产工艺上游阶段最不稳定的单元操作。对于一次性深层过滤器，BioPhorum（BPOG）的指导文件描述了在生物制药生产工艺中应用一次性组件时常见的担忧。根据该指南，过滤器中的可提取物和可析出物（E&L）会对质量和/或工艺性能产生负面影响。此外，工艺步骤越接近最终药物底物（DS）或药物产品（DP），过滤器组件中的可提取物和可析出物带来的风险就越高。

由于澄清过程中使用的深层过滤器通常位于生产流程的上游，因此该过程中深层过滤器产生的可提取物和可析出物 (E&L) 通常会在后续的下游工艺步骤中被清除。稳健的下游纯化工艺可以从质量角度最大限度地减少与 E&L 相关的问题。近年来，细胞培养工艺已转向更高的细胞密度以提高目标产品的产量。因此，澄清过滤器现在不仅包括 CE 和 DE 滤膜，还包括二氧化硅助滤剂。在纯化流程下游的澄清步骤中，E&L 可能构成重大风险。因此，去除这些 E&L 会增加下游工艺的压力，包括除菌过滤、层析分离、切向流过滤 (TFF) 和除病毒过滤。鉴于此，应强调澄清风险评估的重要性，并建议采用基于质量源于设计 (QbD) 的方法。

亚硝胺是化学化合物，根据动物研究，它们被认为是可能的人类致癌物。2018 年年中，欧洲药品管理局 (EMA) 首次发现用于调节血压的药物“沙坦类”中存在亚硝胺杂质，例如 NDMA（N-亚硝基二甲胺）和 NDEA（N-亚硝基二乙胺），并因此召回了相关产品。根本原因评估表明，其原因是二乙胺和二甲胺等杂质在药物合成过程中与亚硝化剂发生反应生成亚硝胺。随后发现的其他案例表明，在适宜条件下，当存在易发生反应的胺类（仲胺或叔胺）和亚硝化剂时，药物在生产或储存过程中生成亚硝胺的风险很高。欧洲药品管理局 (EMA) 于 2019 年发布指南，要求对通过化学合成法生产的药品进行审查，审查方法包括三步：(a) 风险评估，(b) 确证性试验，以及 (c) 风险缓解措施的实施。其他监管机构，例如美国食品药品监督管理局 (FDA)、巴西国家卫生监督局 (ANVISA) 和加拿大卫生部，也采用了类似的方法。过去五年中，有关亚硝胺污染及其缓解策略的信息持续增长。显然，易感胺与亚硝化剂之间的反应会导致亚硝胺的生成，而风险因素与活性物质、成品和药品生产质量管理规范 (GMP) 相关因素密切相关。美国 FDA 和 EMA 在其各自的指南中指出，在适宜条件下，当易感胺存在时，亚硝酸盐可能是药品生产和储存过程中亚硝胺生成的潜在风险因素。因此，药品生产商应与其原料药和辅料供应商密切合作，对其成品中亚硝胺污染的风险进行评估，并制定适当的缓解措施或控制措施来应对该风险。在单克隆抗体（mAb）的上游工艺中，澄清过滤器的过滤纵深较高，来自深层过滤器的任何杂质都会在后续的下游单元操作（例如层析法和切向流过滤）中被去除。

BPOG提出了药物生产中析出倾向的概念，强调随着工艺流程从上游活动到最终药物产品的推进，风险逐渐增加。这种推进过程被称为“沿生产流程的距离 (DAS)”。导致风险升高的关键因素包括暴露温度、暴露持续时间、工艺流体相互作用以及稀释比（考虑表面积与体积的比值）。在上游阶段，会进行诸如细胞库操作、解冻/复苏、接种液制备、扩增、生产、收获等活动。随着工艺进入纯化阶段，会采用亲和层析、病毒灭活、离子交换层析、除病毒过滤以及超滤或洗滤等技术。纯化后，重点转移到药物底物阶段，包括最终过滤、除菌过滤和药物底物产品的储存。最后阶段包括制剂、灌装和包装，其中包括药物底物产品的储存、滴度调整、除菌过滤、灌装和冻干。随着药物生产过程的推进，析出风险逐渐增加，并在最终药物产品中达到峰值。

表2（参见原文）总结了可析出物风险评估（ RA）模型的示例，该模型可应用于澄清工艺。传统上，许多制药公司认为收获步骤风险较低。然而，如果DAS和工艺流体相互作用（PFI）高于之前对澄清工艺的预期，则这种看法可能会发生改变。

由于澄清过程中使用了深层过滤器，因此澄清工艺的生产流距离（DAS）从上游转移到了纯化阶段。具体而言，纯化阶段的过滤环节的评级设定为3，权重调整为0.40后，最终得分为1.2。此外，澄清过程中使用的缓冲液成分也会影响PFI值。缓冲液的pH值或电导率可能较低或较高，这可能导致PFI得分增加到3-5。如果将此因素的权重调整为0.15，则最终得分将为0.45或0.75。

如何将QbD理念应用于澄清工艺

路线图

美国食品药品监督管理局 (FDA )和欧洲药品管理局 (EMA) 强调质量源于设计 (QbD) 在确保生物制药产品质量一致性方面的重要性。QbD 是一种系统性方法，它结合了科学原理和风险评估来优化生产工艺，并为制造商提供必须遵循的指导方针。QbD 的概念包括定义质量目标产品概况(QTPP)，以识别需要在特定限度内控制的关键质量属性(CQA)。然后，通过风险评估来识别潜在风险，并确定影响产品质量的关键工艺参数 (CPP) 和 CQA。实验设计 (DoE) 技术用于系统地研究和优化工艺参数，从而有助于改善这些参数与产品质量之间的关系。通过实施 QbD 原则，生物制药企业可以提高产品质量、优化工艺，并确保在产品生命周期内符合法规要求。

QTPP、CQA、CPP、设计空间和控制策略的阐明

质量源于设计 (QbD) 在生物制造中发挥着至关重要的作用，尤其是在澄清步骤中，它能够以经济高效的方式去除杂质并提高产品质量。通过利用风险评估、控制策略和实验设计 (DoE) 等技术，制造商可以降低工艺变异性并提高一致性。定义质量目标产品概况 (QTPP) 和关键质量属性 (CQA) 可确保安全性和有效性，而控制策略和设计空间则在产品生命周期内进一步支持质量。图 3展示了 QbD 的要素。

图3. QbD要素

QTPP（质量目标产品概况）

QTPP指导剂量、浓度和杂质的预期质量。QTPP 还设定了杂质的可接受限值，有效的澄清工艺可最大限度地降低这些杂质水平。通过使澄清工艺与 QTPP 保持一致，制造商可以优化工艺参数以达到所需的属性，从而确保产品质量和治疗效果。

关键质量属性 (CQA)

澄清工艺应考虑到药物活性成分的滴度、纯度和含量是确保最终生物制药产品质量的关键因素。有效的澄清工艺不应影响药物滴度，但可以去除可能干扰药物活性成分治疗效果的杂质。典型的澄清工艺采用离心、深层过滤或二者结合等技术来去除杂质。通过考虑澄清步骤的滴度、纯度和产品回收率，生产商能够实施适当的控制策略；进行风险评估，从而持续达到所需的质量属性。这最终确保生产出高质量的生物制药产品，这些产品能够发挥预期的治疗效果，符合监管要求，并将患者安全放在首位。

关键工艺参数 (CPP)

澄清过程中的关键工艺参数（CPP）包括离心速度、过滤参数（如通量）、缓冲条件（pH值、渗透压等）、入口压力、过滤器压差和温度控制等因素。这些参数对固相去除率、杂质清除率、产品回收率以及后续产品稳定性均有显著影响。确定澄清过程的关键工艺参数需要基于工艺知识、风险评估和科学理解，以确保产品质量的稳定性。

澄清工艺的风险评估

风险评估是质量源于设计 (QbD) 方法的关键组成部分。它涉及识别、分析和管理产品开发和生产过程中可能出现的潜在风险。这一过程在生物制药生产等复杂流程中尤为重要，因为在产品开发的每个阶段都必须做出关键决策，以保持产品质量的一致性、确保患者安全并最大限度地降低业务风险。失效模式及影响分析 (FMEA)、危险与可操作性分析 (HAZOP) 和故障树分析 (FTA) 是三种常用的风险管理工具。FMEA 评估潜在缺陷模式及其对产品或流程的影响，以提高系统可靠性。HAZOP系统地审查流程设计，以识别操作和安全问题，特别是使用“引导词”来识别流程中的偏差。它追踪复杂系统中潜在缺陷或错误的原因，并将其以可视化的树状结构呈现，从而评估整个系统的可靠性。FMEA 与其他工具结合使用，有助于确保产品质量和安全。

失效模式及影响分析 (FMEA) 是一种用于在产品或工艺设计的早期阶段识别和确定潜在缺陷优先级的工具。值得注意的是，FMEA 并非唯一可用于此目的的工具。该方法通过系统地分析每种失效模式对关键功能的影响，并根据发生的可能性和严重程度分配风险优先级，使资源能够集中于最关键的问题。FMEA 还强调问题预防，从而降低修改成本，提高产品的安全性和可靠性。这种预防方法可以改进产品开发过程中的质量控制，从而节省成本并提高客户满意度。

用于阐明的鱼骨图

鱼骨图（图 4），也称为石川图，可用于识别影响澄清过程的因素。该工具能够可视化因果关系，在质量源于设计 (QbD) 中尤其有用，可用于识别和分类产品或工艺中潜在的问题或质量缺陷原因。鱼骨图可用于系统地分解复杂问题并识别关键原因，从而提高质量控制的有效性。鱼骨图分析片段展示了在 QbD 风险评估 (RA) 和控制策略的开发阶段考虑各种因素的方法的实用性。影响澄清的因素，例如细胞系、工艺、过滤材料、污染和杂质，在优化成功的澄清工艺时至关重要。如图 4所示，这些参数被分为细胞系的不同部分、细胞培养信息、污染、杂质、工艺、过滤材料和过滤参数。

图4. 澄清工艺的鱼骨图示例

FMEA 用于风险评估

为了评估和确定与流程稳健性和生产率相关的风险优先级，我们进行了一项全面的分析，该分析结合了历史数据和对工艺的深入理解。此分析采用了失效模式及影响分析 (FMEA) 方法。在此框架下，我们仔细审查了每个工艺参数的失效概率、潜在影响的严重程度以及检测可能性。这些方面分别进行评估，然后通过乘法组合，得出每个参数的风险优先级数 (RPN)，从而有效地量化了相关的风险等级。总 RPN 使用以下公式计算：RPN = S × O × D。图 5展示了一个基于 RPN 确定风险矩阵的示例。如图 5所示，RPN 值介于 1 到 125 之间。此外，我们还确定了每个潜在失效模式 (FM)类别的平均 RPN。表 4（参见原文）显示了与澄清相关的关键质量属性(CQA) 的 FMEA 结果示例。每个关键质量属性 (CQA) 均根据其概率、严重性和可检测性，按 1 到 5 的等级进行评估。1 分表示无潜在风险，3 分表示中等或可控风险，5 分表示相当大的风险。

图5. 基于RPN的风险矩阵确定示例

澄清工艺开发

早期工艺开发注意事项

许多用于生物工艺澄清应用的深层过滤器通常以纤维素或聚丙烯纤维为基质。这些材料为过滤材料提供了复杂的网络结构和高比表面积。除了纤维状过滤介质外，还嵌入了合适的助滤剂，例如硅藻土、活性炭、硅胶或珍珠岩，以增强对胶体物质和可溶性杂质的吸附。纤维和助滤剂通过聚合物树脂粘合剂粘合在一起，该粘合剂也赋予过滤介质正表面电荷。深层过滤介质通过尺寸排阻机制和电荷相互作用的结合发挥作用，这种作用既可以通过深层过滤器表面的筛分实现，也可以通过深层过滤介质多孔基质内部的筛分实现。此外，带正电荷的深层过滤介质还可以通过静电吸附机制有效地结合带负电荷的杂质，例如宿主细胞蛋白/DNA、病毒和内毒素。过滤助剂和树脂粘合剂的类型可能会在澄清步骤中产生一系列机械和静电去除机制，包括疏水吸附、氢键和混合模式结合相互作用。

在澄清步骤的初始工艺开发阶段，选择合适的深层过滤介质至关重要。所选过滤器的孔径和材质会影响工艺处理能力、产品收率和可溶性杂质分布。制造商通常提供一系列不同标称孔径的深层过滤介质。对于给定的生物进料流，最小的颗粒（<1 μm）包括带负电荷的细胞碎片和胶体物质，这些物质可以通过带正电荷的深层过滤器进行尺寸排阻和吸附相结合的过滤作用去除。应仔细选择过滤器的标称孔径。如果所选深层过滤器的标称孔径过大，则可能无法截留小颗粒，导致下游生物负荷降低过滤器快速堵塞。相反，如果所选深层过滤器的标称孔径过小，则大颗粒会沉积在深层过滤器表面形成滤饼，从而导致深层过滤器快速污染，并显著增加流体阻力。深层过滤步骤中合适的标称微米等级的选择通常根据经验确定，并考虑细胞培养的收获密度、细胞活力以及需要去除的杂质。如果目标杂质是细胞和细胞碎片，则一个好的起点是选择标称孔径相对较大的深层过滤器；而二次澄清或降低浊度可能需要使用带强正电荷且标称孔径较小的深层过滤介质。典型的单克隆抗体生产澄清工艺可能采用两级澄清工艺，包括一级澄清以去除完整细胞和细胞碎片，以及二级澄清以降低浊度并去除低浓度的可溶性杂质。

建立关键工艺流程和关键质量属性

关键工艺参数（CPP）是影响关键质量属性（CQA）的参数。采后澄清工艺的主要目标是去除细胞和细胞碎片等大颗粒，从而减轻下游工艺的负担。

在使用深层过滤器的标准澄清工艺中，产品收率和纯度都至关重要。影响因素包括收获条件，例如总细胞密度（TCD，细胞/mL）、细胞活力（%）和收获时间。其他相关参数包括通量（升/平方米/小时，LMH）、渗透压（mOsm/kg）/电导率（mS/cm） 、温度（°C）和入口压力（psi）。某些物理工艺参数可通过缓冲液条件进行调节。入口压力通常保持在固定/受控水平，由于其直接影响剪切应力，因此至关重要。细胞剪切应力会随着流速和流体粘度的增加而变化。随着流体粘度的增加和流速的加快，过滤器的阻力也会增加，这会导致入口压力升高和细胞裂解，从而增加澄清滤液的杂质含量。建议将入口压力作为澄清过程中的潜在关键工艺参数 (CPP) 进行控制。过大的剪切应力会改变细胞结构，导致杂质含量升高和产品纯度降低。这些参数可作为澄清过程的关键工艺参数。产品收率通过比较澄清前后目标产品的量来确定。产品滴度和回收率是重要的评价指标。此外，还必须验证纯度是否满足特定杂质（例如 HCP、HCD、聚集体和碎片）的含量要求。澄清步骤后杂质的含量要求取决于后续下游工艺步骤将其去除至药物活性成分中令人满意的水平的能力。因此，澄清步骤的要求可能会有所不同。值得注意的是，杂质的清除程度也会直接影响后续纯化步骤的性能，例如层析捕获步骤的填料寿命。当细胞培养收获条件为高细胞密度但低细胞活力时，HCP/HCD 水平高于低细胞密度和/或高细胞活力的细胞培养。此外，与宿主细胞蛋白污染水平相关的滤液浊度被认为是下游工艺的风险因素，因为它会导致除菌过滤器堵塞。这些因素已被确定为潜在的关键质量属性 (CQA)，并且可能因宿主细胞的不同而有所差异。例如，当使用大肠杆菌作为宿主时，内毒素水平是一个关键的 CQA。

细胞裂解程度会影响HCP和HCD的含量，而HCP和HCD的含量可作为纯度标准。细胞活力越低，细胞培养液中这些物质的浓度越高，下游工艺去除难度越大。HCP和HCD主要在细胞培养过程中产生，会影响药物的安全性和有效性。因此，监管机构会设定限值并规范HCP和HCD的含量，以预防感染、过敏反应，并降低药物疗效降低或副作用发生的风险。深层过滤可以部分去除这些物质。

据报道，深层过滤过程中杂质的去除效率取决于通量。当杂质通过吸附机制去除时，较长的滤膜停留时间有助于杂质的去除，从而提高滤液质量。然而，如果杂质仅通过筛分机制去除，则通量的影响会减弱，因为杂质会积聚在滤膜表面（形成滤饼）或堵塞孔隙（完全堵塞）。通量被认为是深层过滤过程中的一个关键参数，尤其是在使用活性炭等吸附机制的深层过滤器时。确定最佳通量对于通过这些方法有效去除杂质至关重要。

深层过滤过程中目标产品的损失可归因于两个因素。如果产品带负电荷，则可能通过静电相互作用吸附到带正电荷的滤膜上。为防止吸附损失，必须检查产品的等电点 (pI) 和缓冲液的 pH 值。最大限度地提高澄清步骤的回收率至关重要，可通过吹扫或缓冲液冲洗来回收深层过滤装置中残留的工艺流体，从而提高产品收率。需要注意的是，由于滤膜的滞留量，吹扫可能无法回收所有产品，但使用合适的缓冲溶液冲洗滤膜可以显著提高产品收率。在回收冲洗过程中应保持适当的盐浓度，以防止额外的收率损失。

表 5（参见原文）展示了通过参考因果矩阵对澄清工艺的CPP和CQA进行风险评估的结果。该因果矩阵还包括用于评估结果的重要性评级以及原因与结果之间的相关性评分。重要性评级越高，表明该原因与所描述的结果之间的相关性越强。

通过实验设计（DoE）进行工艺开发，以确定生产的设计空间

前文描述了CPP 以及杂质在澄清过程中对关键质量属性(CQA) 的潜在影响。这些见解对建立澄清工艺的设计空间具有重要意义。传统上，在生物治疗药物的开发中，澄清一直被视为上游收获工艺不可或缺的一部分。最初的研究重点是细胞培养物的收集，并致力于优化连续离心条件。随后的纯化工艺采用深层过滤器或生物负荷降低过滤器，侧重于过滤器应用研究，而非对工艺参数的深入研究。随着工艺开发技术的最新进展，确定的澄清工艺中的关键因素得以精确定位。此外，人们对工艺杂质对 CQA 的影响有了更深入的了解。这种认识为定义澄清工艺的设计空间提供了可能。表 6（参见原文）描述了产品开发中质量源于设计(QbD) 原则所涉及的步骤。对于工艺开发，可以使用实验设计(DoE) 和单因素实验 (OFAT) 方法来筛选工艺参数和材料。

根据ICH Q8（R2）所述，设计空间涵盖了输入变量（例如，材料属性）和工艺参数之间多维的相互作用和交互，这些变量和参数已被证实能够确保产品质量。在此设计空间内操作不被视为变更，因此无需进行上市后修改。相反，偏离设计空间则被视为变更，通常会触发上市后修订的监管流程。设计空间的提出是申请人的责任，并且必须经过监管评估和批准。

设计空间并非成功实施 QbD 的必要条件；即使没有正式建立设计空间，也可以成功获取和实施产品和工艺知识。

设计空间定义了工艺参数的操作边界及其对制造各阶段关键质量属性 (CQA) 的影响。它包括所有关键工艺参数(CPP) 及其相关 CQA 的可接受范围，这些范围是通过多元分析和实验设计确定的。如果多个 CQA 受同一 CPP 影响，则设计空间的范围可能会受到限制。设计空间对于产品概念化和与质量目标工艺参数 (QTPP) 的一致性至关重要。先验知识、初步风险评估和各种模型有助于识别设计空间的关键变量，从而确保产品质量的一致性。单变量数据可用于确定这些可接受范围；对于现有产品，多元模型会评估历史数据以优化设计空间。为了提高生产工艺的稳健性并最大限度地减少不合格批次的数量，同时满足质量要求，引入了质量源于设计 (QbD) 方法。QbD 基于对工艺的理解，通常依赖于应用实验设计 (DoE) 框架，以便在设计阶段通过实验覆盖广泛的操作空间。全面的实验研究提供了操作空间的子集，称为设计空间，产品质量要求在该子空间内得到满足。

因此，通过将前文中确定的工艺开发过程中考虑的情况整合 为CPP 和CQA 或QTPP 。由此，可以使用实验设计 (DoE) 或单因素实验测试 (OFAT) 方法构建设计空间，并有望通过实验设计实现系统高效的工艺开发。

设计空间研究示例（用于阐明）

设计空间的研究可以分两步进行。第一步是在开发初期，主要进行过滤器或参数的筛选。第二步是在工艺开发的后期，侧重于工艺表征。在第一步中，可以主要利用单因素实验法（OFAT）或筛选实验设计（Screening DoE）来选择过滤器和絮凝方法（包括一级和二级深层过滤器）。在第二步中，可以采用响应面法（RSM）或实验设计（DoE）来验证参数。

早期工艺开发——收获条件优化和深层过滤筛选研究

收获条件优化研究

在工艺开发的早期阶段（从发现阶段到临床前阶段），有许多优化工艺设计的方案可供选择。在此阶段，参与工艺开发的研究人员通常会参考学术文章、研究报告以及商业化深层过滤器的供应商信息工艺开发的第一步是过滤器筛选研究。在启动过滤器筛选研究之前，优化上游工艺（USP）至关重要，尤其是收获条件，包括细胞密度（VCD，cells/mL）、细胞活力（%）、pH值、电导率、渗透压等。这些收获条件会显著影响澄清过程。在过滤器筛选研究中，研究人员通常只关注过滤器的处理量（L/m² ）、过滤器截留率（滤液浊度）和产品浓度（收率%）。然而，如果研究人员将质量源于设计（QbD）理念融入澄清工艺，则需要考虑其他几个重点，例如可能的关键质量属性（CQA），包括HCD、HCP、内毒素、聚集体等。因此，在工艺开发的早期阶段，考虑澄清工艺的代表性CQA至关重要，包括产品浓度（收率%）、HCP水平和内毒素含量。

大多数生物制药公司在工艺开发过程中，优先考虑提高USP（上游工艺）的产品浓度和收率（%）。为了优化USP的设计空间，需要研究pH值、溶氧（DO%）、葡萄糖浓度（g/L）、乳酸水平、培养温度（℃）以及温度变化时间等变量。根据实验设计（DoE）原则，这些参数可以作为X因素，而产品浓度（收率，%）可以作为Y响应值。因此，许多生物制药公司都会开展DoE研究。

如本文所述，这些参数仅关注培养条件。然而，大多数公司可能并不希望过分强调澄清步骤之前的收获条件，而这些条件可能包括一些关键因素，例如收获时的细胞密度（VCD，cells/mL）和细胞活力（%）、乳酸水平、pH值、电导率和渗透压。这些参数会对产品质量产生显著影响。值得注意的是，质量问题不仅限于产品浓度（产率%），还包括杂质，例如宿主细胞蛋白/DNA（HCP/HCD）、内毒素和聚集体。

Bracewell发表了关于影响宿主细胞蛋白清除的收获时间参数的案例研究。结果表明，随着培养时间的延长，Protein A处理后的宿主细胞蛋白（HCP）杂质水平升高，表明产品数量与纯度呈负相关。具体而言，产品数量从第14天到第17天增加了28%，而HCP水平在此期间增加了75%。

Bracewell还进行了一项实验设计（DoE），以探索培养条件对抗体滴度和产品质量之间权衡的影响。他的研究表明，促进抗体产生的条件也会导致Protein A处理后宿主细胞蛋白（HCP）水平升高。基于这些数据，生成了等高线图，以展示能够提供合适工艺窗口的pH值和温度范围，从而平衡上游和下游的高滴度和低HCP水平。

因此，有必要对收获条件进行全面研究；在优化澄清工艺开发之前，应该完成这项研究。

在研究收获条件时，拥有经验丰富、知识渊博的工艺开发团队成员可以显著缩短研究周期。例如，经验丰富的人员可能无需使用诸如全因子实验设计（DoE）等进行大量的初步筛选。相反，他们可以利用对工艺的深刻理解来预测结果，并直接采用更专业的实验设计，例如响应面法（RSM）或定制设计的实验设计。这种精简的方法不仅加快了研究速度，而且通过利用团队内部的专业知识提高了实验效率。

然而，如果该产品是“新药”，或者公司在工艺开发方面缺乏经验或知识，则需要进行大量研究。筛选参数研究和工艺表征研究均可采用全因子设计。因此，该产品从研发到上市可能需要比其他产品更长的时间。

筛选研究

表 7（参见原文）描述了一个过滤器筛选研究的示例。

一级澄清过滤器的目标是大量去除完整细胞、细胞碎片和大颗粒。一级深层过滤器的孔径大于二级深层过滤器。二级深层过滤器的目的是去除小颗粒（<1 μm）和胶体蛋白团聚体。在过滤器筛选研究之后，可以在实验室规模上进行过滤器尺寸研究。该研究有助于确定过滤器配置，并提供有关工艺通量以及一级和二级澄清过滤器比例的信息。基于这些信息，可以进行参数筛选研究。

早期阶段后的工艺开发——澄清参数筛选和工艺表征研究

完成筛选研究后，制药公司可能会启动参数研究，尤其是在临床前阶段，为临床试验做准备时。值得注意的是，临床试验阶段使用的产品与市售产品几乎完全相同。因此，生产参数的开发必须迅速进行，以确保工艺优化不会延误。参数筛选采用实验设计（DoE）方法。作为DoE的核心原则，参数筛选是一种实验方法，能够有效地识别和优化对复杂工艺或系统产生显著影响的变量。该方法对于快速评估多个输入变量对工艺结果的影响尤为重要，并且对于在研发早期阶段了解这些变量的重要性至关重要。

此外，用于定义设计空间的工艺表征研究涉及一系列实验设计和分析技术。这些技术有助于确定每个参数的影响及其可接受范围，重点在于识别在确保产品质量的前提下，最大限度提高生产率和效率的条件。建立设计空间的主要目标是确保工艺始终满足质量标准并提供操作灵活性，从而支持从临床前开发阶段到临床开发阶段的高效过渡。

前文详细介绍了被归类为可能的关键工艺参数的参数 。对这些参数的研究可以分为两部分：第一部分侧重于 USP 期间控制的收获条件，第二部分侧重于下游工艺 (DSP) 期间可归类的澄清条件。

澄清条件

在确定了以产品收率和杂质为重点的收获条件后，上游工艺流体（收获的细胞培养液，HCCF）可作为澄清工艺的代表。过滤器组合和推荐的工艺通量（LMH）可通过过滤器筛选研究和实验室规模的过滤器尺寸研究来确定。表 8（参见原文）通过因果矩阵描述了关键工艺参数（CPP）和关键质量属性（CQA）。基于这些信息，研究人员可以开展优化工艺的研究；然后，可以根据所得结果通过实验设计（DoE）建立设计空间研究。

前文描述了定义完善的澄清工艺的重要考虑因素，包括控制关键工艺参数 (CPP) 及其对关键质量属性 (CQA) 的影响。在可能的关键质量属性中，产品浓度（收率%）、HCP/HCD 和聚集体是最重要的关键质量属性。关键工艺参数包括工艺通量 (LMH) 和缓冲条件（渗透压、电导率、pH）。对于澄清工艺的初始开发，例如筛选参数和质量属性。基于所有这些需求分析 (RA) 和初步研究，可以开展关于已验证可接受的工艺参数的研究。如果对澄清工艺的信息或知识有限，则应采用参数筛选研究（全因子设计，DoE）来全面评估影响关键质量属性的参数。然后应使用响应面法(RSM) 或自定义设计 DoE 来确定设计空间中参数的范围。表 8显示了一个 DoE 研究示例，其中 CPP 包括所有参数和 CQA。

验证、满足和控制所有关键工艺参数 (CPP) 并评估其对关键质量属性 (CQA) 的影响可能十分困难。此外，虽然经典单克隆抗体 (mAb) 的工艺开发信息丰富，但双特异性 mAb 和 Fc 融合蛋白产品的相关信息却少得多。在这种情况下，生物制药公司可能需要从已发表的文章或相关分子的经验中获取更多信息，以帮助确定设计空间。

表 9和表10（参见原文）显示了澄清过程 DoE 的另一个示例（工艺参数包括工艺通量和渗透压）。

表 10展示了一个紧凑的工艺参数设计。基于此类实验设计(DoE) 的结果，研究人员可以使用统计软件（JMP 或 Minitab）创建自定义 DoE。按照指定的运行顺序进行实验后，使用方差分析 (ANOVA) 分析结果，从而确定影响关键质量属性 (CQA) 的关键工艺参数 (CPP) 的有效范围。此外，还可以使用预测分析器确定验证后的范围。预测分析器基于期望值预测目标值的范围。通常，期望值越高，获得最佳结果的可能性也越高。图 6 显示了 JMP 软件的预测分析器。JMP 软件是一款统计程序，被许多生物制药公司用于工艺开发。JMP 具有基本的统计计算功能，例如方差分析(ANOVA)、t检验、方差齐性检验等。该程序也用于 DoE，以构建预测分析器的设计空间。

图6. 以下为预测分析器的示例，以供参考

在查看预测分析器后，研究人员可以使用设计空间分析器来定义目标关键质量属性 (CQA) 的设计空间。例如，如果目标 CQA 水平为产品收率高于 50% 且有害成分 (HCP) 低于 35,000 ppm，则可以建立工艺参数范围，并通过统计方法进行验证。图 7显示了JMP软件中的设计空间分析器示例。

图7. 为了便于理解，这里举一个设计空间分析器的例子

根据这些结果，研究人员可以选择在实验室规模上进行验证运行，以评估 DoE 定义的工艺参数；参数范围可以从正常操作范围(NOR) 更改为已证明可接受范围 (PAR)。

工艺开发——规模放大、技术转移、差距分析

根据设计空间研究，验证运行可能包含 3 至 5 次运行，以证明统计均值和标准偏差的准确性。验证运行将被证明是正态分布的，并且这些运行结果将与通过实验设计 (DoE) 验证的设计具有可比性。这些验证运行被认为具有实验室规模的代表性。对于放大到生产规模（例如 2000 升以上）的情况，建议在试验规模下进行工艺的中间测试，以确保放大过程的稳定性。表 11（参见原文）和图 8 展示了针对不同细胞培养收获条件和所需应用的两级深层过滤器介质配置的过滤器负载要求示例。许多深层过滤器耗材供应商提供指导文件，以帮助选择合适的深层过滤器。

图8. 耗材供应商提供的按规模划分的澄清系统示例

用于实验室规模过滤器筛选和尺寸测定的小型深层过滤器装置现已上市。这些小型装置（20–25 cm² ）通常适用于处理 0.5 L 至 1 L 的HCCF 体积，具体取决于应用需求。然而，对于通常规模在 10 L至 100 L 的中试规模实验而言，该面积被认为不足。不同供应商提供的中试规模装置过滤面积可能差异很大，典型过滤面积范围在 0.11 至 0.55 m² 之间。这些尺寸适用于 5 L 至 100 L 的规模，在某些情况下，这些规模通常被认为是中试规模。

对于规模较大的工艺（100 至 2000 升，涵盖中试和工艺规模），需要配备多个深层过滤装置的硬件系统，其过滤面积大于 1.1 平方米。为了适应更大的处理量，这些装置可以配置为提供10 至 30 平方米以上的过滤面积。

除了提供数据以支持深层过滤装置的放大生产外，放大研究还可用于支持可比性研究。这些研究对于确保关键质量属性（CQA）在从实验室规模到生产规模的各种规模下均能维持稳定，且无显著偏差至关重要。此类验证过程包括首先在实验室规模下进行初步试验，并采用已建立的参数范围。然后，将这些参数应用于中试规模并进行评估，并将评估结果与实验室规模的结果进行比较，以确保一致性。随后，在生产规模下应用相同的参数并进行评估，并采用诸如t检验、配对t检验、方差分析（ANOVA）和西格玛质量水平理论等统计方法来验证不同规模之间是否存在差异。

尽管采取了这些措施，但不同规模下关键质量属性（CQA）差异不显著并不能自动解决所有潜在的质量问题。有效的质量控制和战略管理要求研究人员和制造商对从实验室规模到生产规模的整个过程进行全面的差距分析。这种分析有助于识别和解决不同规模下可能存在的各种差异，从而确保放大生产过程能够维持产品质量并符合监管标准。

本次差距分析也包含风险评估。因此，研究人员和制造商将采用诸如失效模式及影响分析 (FMEA)、故障树分析 (FTA) 或危险与可操作性分析 (HAZOP) 等方法进行风险评估。例如，本次差距分析将重新审视使用 FMEA 计算风险优先数 (RPN) 的方法。

差距分析可在技术转移至生产制造（技术转移）之前进行。作为技术转移的一部分，需要审核大量文件。其中，工艺开发研究报告对于在生产工厂的实施至关重要。差距分析的目标分数可能因公司或产品而异。因此，建议根据制造商自身的具体情况和生产环境要求，量身定制风险评估方法。

结论

在生物制药生产过程中，澄清工艺历来被视为上游收获工艺的一部分，并且认为该工艺步骤中产生的任何工艺相关杂质对关键质量属性（CQA）的影响都微乎其微。因此，澄清工艺的重要性一直被低估。本文从质量源于设计（QbD）的角度评估了澄清工艺的重要性。我们阐述了各种澄清工艺参数（例如通量、渗透压、电导率和pH缓冲条件）作为关键工艺参数的潜力。对这些参数的评估也支持了控制被定义为CQA的杂质的可能性。此外，我们还描述了使用实验设计（DoE）来设定这些研究参数的方法。除了工艺开发之外，我们还描述了风险评估方法，这些方法可以改进整个澄清工艺的质量控制。深层过滤产品作为下游单元操作用于降低浊度和清除可溶性杂质的日益普及，进一步提升了从QbD角度来看澄清工艺的相对重要性。

加强质量控制方法不仅符合现代监管要求，而且显著提高了生物制药生产的可靠性。通过将严格的质量源于设计（QbD）标准应用于澄清工艺，有助于推动生物制药行业达到更高的安全性和质量标准。这种积极主动地提升生物制药生产流程质量和稳健性的方法，有助于推动药物创新和患者护理的进步。

原文：K.Yeop, H.Nam, C.Shim, et al., et al., Optimizing clarification processes in biopharmaceutical manufacturing through quality by design: Strategies, implications, and future prospects. Biotechnology Progress, 2025.

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