细胞污染的预防

预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。

在超净台中进行细胞培养时，特别注意在进行移液，倾倒液体的操作过程会产生飞沫并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生，飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染的发生，应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用，如胰酶、培养液等。否则，一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。一般预防可从以下几方面着手：

无菌操作基本技术

1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以5%新洁尔灭擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以5% 新洁尔灭擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以5% 新洁尔灭擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

操作注意事项

1、从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用，并且需要尽快使用，特别注意容易染菌的液体如培养基，琼脂糖，血清等需要在低温保存，减少染菌的几率。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。。2、从操作者做起(1)操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。在制定好实验步骤后，头脑清醒的进无菌室进行实验。备好一切所需要的试剂和培养瓶，防止在操作过程中来回跑动寻找，增加染菌的几率。在实验前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5 分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用5%新洁尔灭擦手、擦带进的培养基瓶壁，和无菌操作台。严格遵守无菌操作规则。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。尽量减少在超净台中物品的放置，特别注意不能将物品放置在流通空气的虑孔上，以免降低整个超净台的工作效率。(2)操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼，注意火苗要旺盛，如果酒精灯中的酒精用尽要及时补充。要尽量使用侵斜试剂瓶45°的管架，减少垂直放置培养瓶造成染菌的机会。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。(3)操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。(4)操作过程中头脑清醒，动作敏捷果断，打开的培养瓶和瓶口应远离操作者手势范围，避免影响垂直的空气流将操作者身上的病菌带到培养细胞中。废液钢尽量避免使用敞口的容器，倾倒时要抬高一点，防止在倾倒废液时溅起的液体污染瓶口。(5)防止细胞交叉污染在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。