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20周年特辑 | 复方氨基酸注射液中胱氨酸含量的测定方法

乔晓芳、蒋芙蓉、刘再德、兰香南、周慧 2023-11-20

本文建立了一种复方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸含量的测定方法。在碱性条件下，采用1，4-二硫代苏糖醇将胱氨酸还原成半胱氨酸，生成的半胱氨酸与酸性茚三酮溶液反应，生成红色产物，在560 nm波长处测定吸光度，用对照品标准曲线法测定复方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸的含量。测定结果显示胱氨酸浓度在0.0418 ～0.2088 mg/ml范围内线性关系良好（r=0.9992）; 平均加样回收率为101.61%（RSD为1.96%，n=9)。这证明本方法准确、重现性好，可用于复方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸的含量测定。

复方氨基酸注射液在临床上应用广泛，目前在临床应用的品种主要有补充营养用氨基酸、小儿用氨基酸、肾病用氨基酸和肝病用氨基酸，适用人群包括老人、成人、儿童，主要以中心静脉插管或由外周静脉滴注，还有补充氨基酸的口服制剂在临床应用^[1-8]。复方氨基酸注射液（18AA）含必需氨基酸与非必需氨基酸，在临床主要用于蛋白质摄入不足、吸收障碍等氨基酸不能满足机体代谢需要的患者。鉴于当前质量标准中未对胱氨酸的含量进行测定^[9-11]，特开展复方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸含量检测方法的研究，便于全面控制该品种的质量。

PART.1

试验材料

1.1

仪器

UV2450双光束紫外-可见分光光度计，岛津公司产。电子分析天平BP211D，北京赛多利斯仪器系统有限公司产。电子天平ES-1000HA，长沙湘平科技发展有限公司产。

1.2

样品与试剂

复方氨基酸注射液，批号：C120426 C；规格：500 ml：25 g（总氨基酸）；湖南科伦制药有限公司产。胱氨酸对照品，中国药品生物制品检定所提供。盐酸为分析纯。二硫代苏糖醇为分析纯。茚三酮为分析纯。试验用水为湖南科伦制药有限公司自制。其他试剂均为分析纯。

PART.2

方法与结果

2.1

测定方法：

标准曲线制备：称取胱氨酸对照品适量，用少量0.1 mol/L盐酸溶解后用水稀释制成每1 ml中约含0.5 mg的溶液，分别精密量取1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别精密量取2.5 ml稀释后溶液置10 ml量瓶中，加入酚酞指示液3滴，再加10 mol/L氢氧化钠溶液50 μl使溶液呈红色，精密加入二硫代苏糖醇溶液（取1，4-二硫代苏糖醇40 mg，加水溶解并稀释至25 ml）2.5 ml，用水稀释至刻度，摇匀，在室温放置30 min后，精密量取1 ml置25 ml具塞试管底部，精密加入冰醋酸1 ml和酸性茚三酮溶液（取茚三酮0.5 g，加冰醋酸6 ml和盐酸4 ml使之溶解）1 ml，轻轻摇匀，密塞，在90℃水浴中准确加热10 min，立即冷却，最后精密加入乙醇15 ml，摇匀。在560 nm波长处测定吸光度，以吸光度与其相应的浓度计算回归方程。

测定:精密量取复方氨基酸注射液2.5 ml置10 ml量瓶中，从上述“加入酚酞指示液3滴”开始，依法操作，测定吸光度，由回归方程计算胱氨酸的含量。

2.2

方法原理

在碱性条件下，采用1，4-二硫代苏糖醇将胱氨酸还原成半胱氨酸，生成的半胱氨酸与酸性茚三酮溶液反应，生成红色产物，在560 nm波长处测定吸光度，用对照品标准曲线法测定注射液中胱氨酸的含量。

2.3

验证

2.3.1 专属性

空白溶液配制：按处方量称取除胱氨酸以外的各原辅料，配制成溶液，精密量取2.5 ml置10 ml量瓶中，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。

对照品溶液配制：精密称取胱氨酸对照品13.98 mg置25 ml量瓶中，先用适量0.1 mol/L盐酸溶解后，再用水稀释至刻度，摇匀，精密量取2.5 ml稀释后溶液置10 ml量瓶中，按照“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。

供试品溶液配制：精密量取C120426 C批复方氨基酸注射液（18AA）2.5 ml置10 ml量瓶中，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。

扫描上述样品，结果显示对照品溶液和供试品溶液在560 nm有最大吸收，空白溶液基本无干扰。

2.3.2 线性范围

精密称取胱氨酸对照品（140624-200805）20.88 mg置50 ml量瓶中，先用适量0.1 mol/L盐酸溶解后，再用水稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备液。分别精密量取1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml对照品贮备液置于10 ml量瓶中，用水稀释至刻度。分别精密量取2.5 ml稀释后溶液置10 ml量瓶中，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。结果见表1。

表1 胱氨酸含量测定——线性与范围

结果表明胱氨酸浓度在0.0418 ～0.2088 mg/ml范围内线性关系良好。样品测定浓度在0.1 mg/ml，在此范围内。

2.3.3 空白回收试验

低浓度样品溶液配制（55％）：精密量取线性范围项下对照品贮备液1.3 ml置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，精密量取2.5 ml置10 ml量瓶中，加空白溶液2.5 ml，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。平行制备3份样品。

中浓度样品溶液配制（100％）：精密量取线性范围项下对照品贮备液2.5 ml置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，精密量取2.5 ml稀释后溶液置10 ml量瓶中，加空白溶液2.5 ml，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。平行制备3份样品。

高浓度样品溶液配制（120%）：精密量取线性范围项下对照品贮备液3 ml置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，精密量取2.5 ml稀释后溶液置10 ml量瓶中，加空白溶液2.5 ml，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。平行制备3份样品。

将上述样品测得的吸光度用线性范围项下的标准曲线计算含量，结果见表2。

表2 胱氨酸含量测定——空白回收试验

表2的结果表明该方法准确度好。

2.3.4 重复性试验

精密量取复方氨基酸注射液（18AA）2.5 ml置10 ml量瓶中，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。平行制备6份。测定结果见表3。

表3 胱氨酸含量测定——重复性试验

表3的结果表明该方法重复性较好。

2.3.5 溶液稳定性试验

精密称取胱氨酸对照品12.62 mg置25 ml量瓶中，用少量0.1 mol/L盐酸溶解后，加水稀释至刻度，分别精密量取0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取2.5 ml置10 ml量瓶中，按照前文“2.1”项下“加入酚酞指示液3滴”起，同法操作。另精密量取复方氨基酸注射液（18AA）2.5 ml置10 ml量瓶中，同法测定（分别放置一定时间后再测定吸收值）。计算供试品中的胱氨酸含量。结果见表4。

表4 胱氨酸含量测定——溶液稳定性

表4的结果表明本品在显色反应完成后，吸收值有下降趋势，所以应尽量在30 min内测定。

2.3.6 耐用性考察

按照前文“2.1”项下方法，考察本试验中反应温度、时间不同对胱氨酸含量测定的影响。结果见表5。

表5 胱氨酸含量测定耐用性考察

从表5的试验结果可以看出，反应温度在80℃～100℃、反应时间在5～15 min范围变化时，胱氨酸含量测定结果有一定的差异，耐用性不是很理想，但在90℃准确反应10 min时该方法准确度、线性、重复性均好，这表明操作时需注意反应条件及反应时间。

2.3.7 样品测定

取C120426 C、C120426 D、C120426 E三批复方氨基酸注射液（18AA）样品，分别按照前文“2.1”项下进行测定，反应温度为90℃，反应时间为10 min。结果见表6。

表6 胱氨酸含量测定结果

PART.3

讨论

在现有的复方氨基酸注射液（18AA）国家标准中均未收载胱氨酸含量的相关内容，但胱氨酸确为该产品的有效成分之一，增加胱氨酸含量检测是有必要的。以上方法的线性、准确度、重现性均比较好，虽然耐用性不理想，但通过控制反应条件、加强检验人员的考核便能够使检验结果稳定准确，不失为一种可行的测定方法。

参考文献

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撰稿人 | 乔晓芳、蒋芙蓉、刘再德、兰香南、周慧

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发

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