高浓度抗体冻干工艺开发（二）复溶时间

康瑜 2022-11-09

含有高浓度蛋白质的冻干产品具有较长且可变的重建时间。从药品管理的角度来看，重建时间过长是不可取的；克服重建时间过长的问题可以改善病人用药体验和药效和市场上同类产品实现差异化。

冻干HCPF的复溶时间极长，可达 30 分钟和更长；
随着蛋白浓度的增加，复溶时间也相应延长；
缩短复溶时间是HCPF冻干产品的主要挑战和目标；

图一： 蛋白质浓度范围为 40 至 210 mg/mL 的冻干单克隆抗体制剂的复溶时间；所有冻干物均用 5 mL 注射用水复溶，并在 25°C 下轻轻摇动 (200–250 rpm)，直至滤饼固体完全溶解

Part

影响因素

广泛评估，HCPF冻干制剂的复溶时间取决于以下因素：溶质的部分结晶度、粉饼中固体的润湿性、粉饼的多孔结构，特别是孔径和孔径分布、液体渗入粉饼的能力，粉饼崩解趋势、粉饼水合率和粘度；

其中一些因素似乎比其他因素更能影响重建时间；

已知一些因素会共同发生变化。例如，已发现粉饼的抗压碎性取决于结晶度和孔径；

液体渗透孔隙的能力与构成孔壁的固体的润湿性和孔径大小有关；

因此，本工作的第一个目标是：确定影响复溶时间的各种条件之间的相关性，了解这些相关性背后的原因，然后筛选出影响复溶时间的主要因素。

Part

研究数据

针对含有可结晶辅料处方的研究：

结晶性和较大的孔隙可以极大改善粉饼的润湿性，还可以帮助溶剂液体快速渗透到部分结晶蛋糕中，最终形成分散良好的部分溶解蛋糕小块；

甘露醇的结晶性对复溶时间的影响

图二：不同浓度配比所对应的复溶时间：

蓝色代表 4.5% 蔗糖和 2.5% 甘露醇处方，甘露醇：蔗糖=0.56；

红色表示 2% 蔗糖和 4% 甘露醇配方，甘露醇：蔗糖= 2.0；

加入甘露醇，有可能缩短复溶时间，但蔗糖和甘露醇的比例很重要；

不合适的比例不能明显缩短复溶时间。

表一：蛋白质/蔗糖浓度与冻干样品结晶度和复溶时间之间的相关性

文献显示，较高的蔗糖和蛋白浓度会抑制甘露醇的结晶，表一数据显示甘露醇是否结晶对高浓度抗体产品的重建时间有着显著的影响；

部分结晶处方样品显示出：

接触角更小（润湿性更好）；
更快的跌落穿透时间（液体渗入蛋糕内部更快）；
较低的压碎阻力（蛋糕的抗压碎性更差）；

以上结论由甘露醇实验数据得出，但可适用于其他部分晶体辅料处方。

预冻阶段，加入退火，可以帮助缩短此类处方样品的复溶时间，如下图三；

图三：退火、未退火结晶辅料处方复溶时间对比

是否因为退火促进了晶体的结晶，从而帮助缩短复溶时间？答案见文后图五

预冻速率以及一次干燥条件对复溶时间的影响

图四：不同预冻以及一次干燥工艺对部分结晶处方复溶时间的影响

蓝色点：慢冻-保守干燥

红色点：慢冻、激进干燥

蓝色斜线：快冻、保守干燥

红色斜线：快冻、激进干燥

慢冻获得更大冰晶，复溶速度更快；
快冻获得更小的冰晶，复溶速度更慢；
激进或保守干燥工艺，对复溶时间没有明显的影响；

那么，部分结晶辅料和无定形辅料处方，在同样采用慢冻、保守干燥工艺的条件下，复溶时间的对比又是怎么样的呢？

见如下图五：

图五：预冻阶段加入退火对不同浓度、不同处方抗体产品复溶时间的影响

Cycle 1 为：慢冻、无退火、保守干燥（无定形）

Cycle 2为：慢冻、有退火、保守干燥（部分结晶）

通过图五数据可以看出，很有意思的几点：

无定形辅料处方，预冻阶段无退火（Cycle 1）则复溶时间随着蛋白浓度的增加而增加，蛋白浓度从70到140mg/ml则对应的复溶时间从6分钟延长到16分钟；
部分结晶辅料处方，预冻阶段加入退火（Cycle 2），蛋白浓度从70 到 127 mg/ml则对应的复溶时间仅从5分钟增加到7分钟；
同样蛋白浓度，部分结晶辅料处方+退火，复溶时间普遍比无定形辅料更短；

是否因为慢冻过程，帮助甘露醇更好的结晶，从而缩短了复溶时间呢？

图六：用X射线粉末衍射法测量样品的结晶度

图五的数据显示，在样品的结晶度和复溶时间之间，没有明显的关联；（数据仅供参考）

图七：部分晶体处方及无定形处方，不同孔径复溶时间对比

样品部分结晶和更大的孔径，两个条件集合之后，对于复溶时间的缩短有了明显的帮助；

泡沫对复溶时间的影响:

无定形辅料处方，比部分结晶处方的润湿性差；

溶剂穿透孔隙的能力以及由此产生的快速复溶能力远远低于部分结晶蛋糕，事实上，对于一些无定形蛋糕，溶剂根本没有穿透蛋糕。

因此，在复溶的过程中我们可以看见大块的蛋糕漂浮在溶剂中，很长时间都没有完成复溶，并在复溶的过程中形成气泡或泡沫；

无定形处方通常形成的不是泡沫，而是比较大的气泡，气泡在溶剂侵蚀蛋糕表面的过程中形成；

部分结晶处方一方面可以帮助更快速复溶，但同时也会促进产生泡沫；

复溶时形成的泡沫，裹挟着一部分蛋糕碎片，悬浮在溶液上方，阻止溶剂和这部分蛋糕碎片接触，从而延长复溶时间；

对于部分结晶处方来说，总复溶时长通常主要由悬浮在溶剂中，最后完成复溶的10-20%部分的复溶时长决定；

图八：不同蛋白、糖配比，不同处方，采用不同冻干工艺最终产品复溶时间对比

Cycle1（灰色）：慢冻+激进干燥工艺

Cycle2（蓝色）：慢冻+保守干燥工艺

Cycle3（红色）：快冻+激进干燥工艺

Cycle4（绿色）：快冻+保守干燥工艺

Cycle5（黑色）：慢冻+退火+保守干燥工艺

条形图花纹部分前90%蛋糕复溶花费的时间、实心部分为后10%蛋糕复溶花费的时间由图八数据，我们可以得出结论：

对于无定形辅料处方来说，前面70-80%的蛋糕溶解，花费了大部分的复溶时间。后面10-20%蛋糕溶解，不会消耗很长的时间；
对于部分结晶辅料处方来说，最后10%的样品消耗了大部分的复溶时间。这也间接说明了，泡沫包裹蛋糕碎片，会导致复溶时间延长；
慢冻+退火，对于部分结晶辅料的处方来说，可以大幅缩短复溶时间；
一次干燥条件采用激进或者保守工艺，对于复溶时间没有明显的影响；
对于无定形辅料处方来说，单一的快冻、慢冻条件，不会对复溶时间有明显的影响；

综合以上：

部分结晶处方比完全的无定形处方，可以实现更短的复溶时间；
但很多变量不是单一因素即可发挥作用；
对于部分结晶处方，处方中蔗糖和甘露醇的比例影响着甘露醇的结晶度，进而影响高浓度抗体的重建时间；
产生大冰晶的工艺有助于缩短复溶时间（如慢冻、退火）；
部分结晶处方叠加更大的冰晶，可以在缩短复溶时间上有更明显的效果；
复溶过程中产生的泡沫，会导致整体复溶时间延长，尤其针对部分结晶处方；

参考文献

[1] S.S. Kulkarni, et al., Mechanisms by which crystalline mannitol improves the reconstitution time of high concentration lyophilized protein formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 131 (2018) 70–81

[2] W. Cao, et al., Rational design of lyophilized high concentration protein formulations-mitigating the challenge of slow reconstitution with multidisciplinary strategies, Eur. J. Pharm. Biopharm. 85 (2) (2013) 287–293.

[3] Shreya S. Kulkarni a, Key factors governing the reconstitution time of high concentration lyophilized protein formulations 2021

[4] K.E. Beech, et al., Insights into the influence of the cooling profile on the reconstitution times of amorphous lyophilized protein formulations, Eur. J. Pharm. Biopharm. 96 (2015) 247–254.

[5] P. Sane, et al., Reconstitution of Highly Concentrated Lyophilized Proteins: Part 1 Amorphous Formulations, J. Pharm. Sci. 109 (5) (2020) 1681–1691.

[6] S.S. Kulkarni, Overcoming Long Reconstitution Times of High Concentration Lyophilized Protein Formulations (2019). Doctoral Dissertations, 2105. https:// opencommons.uconn.edu/dissertations/2105.

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撰稿人 | 康瑜

责任编辑 | 胡静

审核人 | 何发

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