现代化的一次性生物反应器能够实现先进的强化细胞培养策略，并减低复杂生物工艺过程中相关操作风险，同时，结合其他先进的细胞截留设备、培养基配置系统、双孔径气体分布器、尾气冷却器以及在线细胞密度测定等一系列配套技术，最终实现了大规模灌注培养与高密度分批补料培养。

灌注培养是一种众所周知的药物生产方法，多年来已被广泛的应用于许多生物技术药物的生产工艺中，如凝血因子（凝血八因子Ⅷ：拜耳的Kogenate与辉瑞的Refacto；凝血七因子Ⅶ：诺和诺德的Novoseven）、蛋白质C（礼来的Xigris）以及其它酶类药物，当然还包括单克隆抗体（杨森生物技术的ReoPro与的Remicade；诺华的Simulect，等）。最近，灌注培养还被用于高细胞密度的种子培养，以缩减达到最终生产规模所需的种子培养步骤。

随着细胞培养技术的不断改进，高密度补料分批培养与灌注培养的结合能够实现更高的细胞密度与产品表达浓度，因此如今只需更小的培养体积与生物反应器规模，便可生产治疗性蛋白质或抗体。这项技术的发展使得生产设备的规模更小，进而减少了从临床研究规模放大到商业化生产规模过程中不可预计的一些问题。目前细胞培养工艺愈来愈得到强化，使用一次性反应器也将变的更具有优势，一次性生物反应器BIOSTAT SRT能够提供最大可达2000L的生产规模，获得过去10~20倍甚至更大的生物反应器才能实现的生产规模。此外，最新的细胞培养工艺的目标是维持细胞处于良好的代谢状态，以控制蛋白质的折叠与糖基化，确保获得质量稳定的产品，因此其主要目的并非必须达到非常高的细胞密度，而是必须确保生物反应器中稳定的营养物质供应与代谢产物生成。

如何进行高密度分批补料培养或灌注培养

在生物反应器接种以及初始1~2天的分批生长阶段后，开始采用适当的设备（如Refine ATF系统）以恒定的收获流速去除无细胞上清液，同时，在培养液中补充新鲜的培养基。

关于细胞截留有许多设备可选，比如连续式离心机（Pneumatic Scale Angelus公司的Centritech Cell或KBI公司的kSep）、内置或外置旋转过滤器、沉淀器、中空纤维以及其它膜的截留系统等。

当使用一次性生物反应器（如BIOSTAT STR等）时，培养基的添加由进料泵控制：进料泵接收到由称重元件或台秤发出的信号，然后根据信号调节培养基的添加量，将生物反应器的重量维持在给定的值。由于细胞密度增加，需要消耗的营养物质也随之增加，并且形成了更多的代谢物，因此需要在之后的工艺中提高收获速率，以保持单位细胞浓度下恒定的新鲜培养基补充速率，或者每天以给定的频率更换培养基[2]。在线生物量的测定（如BioPAT ViaMass探针，将很快可用于BIOSTAT STR与RM培养中）提供了一种基于细胞密度的测定而实现全自动控制灌注速率的选择。通过在线葡萄糖与乳酸测量（如通过BioPAT Trace），可以采用额外的浓缩补料来控制葡萄糖的浓度。基于BIOSTAT STR的典型灌注培养或高密度分批补料培养设置见图1。

考虑要素

典型的灌注速率应该处于每天1~2倍生物反应器体积的范围内。当采用较小流量进行细胞液排放时，可以实现稳定的细胞生长速率，并且通过这种方法维持较高的细胞存活率，而较高的细胞存活率也可以减轻细胞截留设备的堵塞情况。通过细胞截留膜无论是从无细胞收获液中（浓缩灌注），或是从生物反应器内的发酵液中（高密度分批补料）都可回收产品。由于大多数抗体是非常稳定的，因此产品能够在生物反应器中累积，高密度补料分批培养是一种能够提高设备单位时间内产出的简单而直接的方式。在许多实例中，重组蛋白质非常容易发生降解，也有可能显示反馈抑制，因此需要将重组蛋白从细胞培养液中转移到低温的收获罐中，才能进行进一步的纯化，所以浓缩灌注培养是重组蛋白质生产的首选方法。

培养基流向工艺

在大规模的连续培养工艺中，需要特别注意培养基与收获液的流向工艺。根据生物反应器规模与所选的灌注速率，必须每天提供500~2000L甚至更多的新鲜培养基。FlexAct MP系统是一款使用简便的一次性全自动培养基制备系统（图2），它专为减少工作量并提高大规模持续操作的便利性而设计。该设计包括，将粉末培养基无尘转运至混合袋的传输设备、用于pH测量与调节的一次性使用传感器、全自动无菌过滤的管理控制器，以及将物料转运至储存袋的传输设备等。在灌注培养工艺中，必须收集等体积的收获液用于后续的纯化步骤，Palletanks系列可满足在一次性使用储液袋中储存大体积收获液的的需求。综上所述，同时安装有Palletanks以及Flexel储液袋的FlexAct MP系统，能够在大规模的一次性使用连续培养工艺中，实现具有挑战性的全自动料液处理、储存和转移。

放大连续工艺

高密度分批补料培养与灌注培养工艺可以通过采用Sartorius搅拌式一次性生物反应器，结合不同尺寸的Refine ATF模块进行灌注培养工艺开发，并且已经成功实现在生产规模中的应用。在2?L的实验室规模中，我们将UniVessel与BIOSTAT B或B-DCU控制器联合使用，提供一种完全可放大的工艺开发系统。

在BIOSTAT STR中，50L与200L规模可以放大至2000L规模。在较大规模的BIOSTAT STR中，可以使用两个1英寸的无菌连接器，通过一次性培养袋的侧孔，将ATF模块连接至生物反应器的外部环路并在其中进行操作（图7）。这个外部环路必须尽可能地短，以避免细胞培养液长时间暴露于不可控的条件下，如不同的温度或潜在的氧气受限等因素。

适用于强化细胞培养的一次性生物反应器配置

高密度分批补料与灌注培养成功操作的关键是该培养设备必须要具备一套有效的通气系统，该系统能够提供高于10~15h-1的KLa值，并且可为培养液提供足够的氧气（图3）。同时，当进行强化细胞培养时，反应器中会形成过多的CO2，因而必须去除这些CO2，以避免对生产率或甚至产品质量产生任何负面作用。

一个不容忽视的问题是，在高密度细胞培养过程中，较高的气体流速与蛋白质含量会导致尾气中形成过多的气溶胶。根据众所周知的板式换热器原理，开发了一款一次性使用尾气冷却器（图5），该冷却器能够降低过滤器阻塞的风险并显著提高工艺的可靠性。在BIOSTAT STR生物反应器的控制软件中编程有安全锁程序，如果细胞截留设备发生堵塞，该安全锁能够防止生物反应器溢流发生。如果生物反应器中的压力超过最大的预定义操作压力，作为最坏情况下的安全锁，它将停止所有的进料泵并中断所有气体流量。

结语

现代化的一次性生物反应器能够实现先进的强化细胞培养策略，并减低复杂生物工艺过程中相关操作风险，同时，结合其他先进的细胞截留设备、培养基配置系统、双孔径气体分布器、尾气冷却器以及在线细胞密度测定等一系列配套技术，最终实现了大规模灌注培养与高密度分批补料培养，并可成功应用于从临床试验到商业化药物生产领域。