用于2 000 L一次性生物反应器的澄清收获系统——需要一次性使用技术与不锈钢技术紧密结合。目前大多数案例均采用了自行设计的设备集成方式。然而，巧妙地应用混合式系统设计，完美地结合不锈钢技术和一次性使用技术才是更好的解决方案。同时，用户可以借助供应商的技术资源进一步降低系统运行过程中的风险。
文/ Wilfried Kappel，孙仁峰， 乌日图牧仁

近年来，随着对单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb) 商业化产能需求的不断提升，新建商业化设施项目越来越多。其中大多数项目都采用了一次性使用设备，因为一次性使用技术能够提供高度的灵活性，使得这些设施能够兼容不同产品的生产工艺。大多数项目采用了2 000 L规模的生物反应器，这是目前生物制药行业的普遍标准。2 000 L一次性生物反应器也是当前已成功投产的最大规模的案例。一条下游纯化生产线可以同时满足多达4台2 000 L生物反应器交替生产所需的纯化产能。按照典型的批次培养周期为2周计算，每周可以完成2个生产批次的收获操作。
由于这些项目在收获工序都不可避免地引入了不锈钢设备，因此，这些宣称为一次性的生产设施实际采用的仍然是混合式（Hybrid）系统[1]。几乎所有生物反应器规模为2 000 L的生产设施都是如此，因为收获和初步澄清环节常采用离心机来完成离心工艺，而离心机是不锈钢设备。2 000 L生物反应器的料液收获工序通常采用离心技术，因为其运行成本较低，且工艺开发相对简单[2]。
但在工业实践中，我们经常发现收获房间的设备安装和连接形式是自行设计的。来自不同供应商的工艺设备只是被简单地串接起来，并且整个系统能否成功运行完全是用户的责任。本文描述了一种用于单克隆抗体收获澄清的高度集成化混合式系统概念。本文所述的设计，通过一次性使用技术与不锈钢技术的完美结合，提供了一种高性价比、功能稳健的生产系统。

自行设计的设备集成方式
一种典型的用于单抗收获澄清的设备集成方式如工艺流程图（图1）所示，设备位于不同房间，一次性生物反应器在细胞培养间，离心机和深层过滤系统在收获间，而收获袋位于纯化间。生产培养结束后，一次性生物反应器内的料液通过蠕动泵输送给离心机。离心机的出口与最终澄清用深层过滤系统之间安装了一个缓冲袋，用于平衡离心机与深层过滤系统的流量。深层过滤系统的出口直接与纯化间的收获袋相连。
离心机和深层过滤系统的主要流路都采用不锈钢部件，因此需要进行在线清洗（Cleaning in Place, CIP）。仅为收获房间配套一台独立的CIP工作站将大大增加收获系统的成本，因此通常由离心机附带一个CIP罐，而深层过滤系统的CIP则由另一台移动式CIP单元完成，或者只是通过袋子中的清洗缓冲液进行冲洗。所有单元设备之间的连接都采用一次性使用软管。如果是连接至不锈钢设备，则需要采用特殊设计来确保在CIP过程中整个不锈钢部分不存在清洗死角。
主要设备之间通过软管来连接对于软管的排布也提出了很高的要求，因为细胞培养间、收获间、纯化间之间的距离可能较远而且存在穿墙操作。另外，深层过滤器在使用前需要用WFI进行高流量冲洗，这可能会导致泵吸入侧的软管因负压而被吸瘪。按图示中的集成方式，设备之间的连接是开放式操作，这通常也是需要避免的。
以上所描述的简单集成系统需要许多手动操作，自动化程度非常有限，这不符合商业化生产系统的期望。最后需要指出的是，以上这种设备集成方式只能由用户自己去设计和实现，其中包括与各供应商之间的沟通和协调，这也是一项非常繁杂冗长的任务。

巧妙的工艺设计
高度集成化的单抗收获澄清系统概念如详细工艺流程图（图2）所示，它恰当地应用了混合式集成技术，克服了自行设计集成方式的问题，并具有额外的优点。它的基本概念基于以下三个原则：
将离心机的CIP罐独立出来成为一个工艺罐，并将它用于其它用途；
延长离心机的不锈钢进液和出液管路，从而作为从一次性生物反应器至一次性收获袋之间的不锈钢转移管路；
通过Steam-To阀作为卫生级接口，连接一次性使用组件（袋子、过滤器）与不锈钢转移管路。
该集成化收获澄清系统的良好设计必需要考虑到相关的生产工艺和主要设备参数，充分调和以避免造成设计缺陷或过度设计。表1总结了该工艺设计中考虑到的所有参数。这些所选用的参数适用于GEA的CSC 20离心机[3]和Merck的Millistak+ Pod抛弃型深层过滤系统[4]。它们是生物行业内常用于单抗收获澄清的两种设备。然而需要说明的是，这些工艺参数也可以类推到其它供应商的相似设备。
遵循以上第一个原则，该工艺罐首先作为CIP罐用于CIP流体储存并且通过CIP供给泵输送至各个待清洗对象。CIP对象不只是离心机，也包括深层过滤系统和所有的不锈钢转移管路。其次，该罐体也作为缓冲罐，用于平衡离心机和深层过滤系统的流量。该工艺罐的第三个用途是作为WFI储罐，用于深层过滤器的WFI预冲洗。深层过滤器的WFI冲洗过程需要较高的WFI流量（见表1）。

该工艺罐配置了一台泵，这台泵也有三个用途。该泵被用作CIP泵时需要在高流量下运行，被用作WFI冲洗进液泵时需在中等流量下运行，被用作过滤进液泵时需在低流量下运行。四元隔膜泵，如Quattroflow QF4400S[5]，能够在很宽的流量范围内运行，很好地满足了上述所有应用需求。
遵循以上第二个原则，收获间的不锈钢料液转移管路向上游延伸至细胞培养间的一次性生物反应器，向下游至纯化间的一次性收获袋。在细胞培养间的转移管路也将用作离心机CIP时的供给管路，与离心机一起清洗。离心机下游至纯化间的转移管路在清洗时采用单程冲洗至排水管路的方式。
如图2所示的集成化系统也能够进行在线蒸汽灭菌（Steaming in Place, SIP），包括离心机、工艺罐和所有不锈钢转移管路。
与常用的设备集成方式相比，以上所述的集成化混合式系统所需的设备更少，但具有更高的自动化水平。更进一步地，如果由同一个供应商来负责工艺罐、深层过滤系统和所有的不锈钢转移管路，项目中的交接面数量就会减少。

最新的设备设计
阀环技术的应用使得管路设计非常巧妙，从而实现了同一个工艺罐和工艺泵能够用于三种不同功能。在欧洲，阀环技术的运用是卫生级管路系统中常见的做法。由T-阀和Y-阀组成的阀环，能够实现所有料液接触不锈钢管路的完全清洗和排放，无死角和盲端。
遵循以上第三个原则，所有一次性使用部件/管路与不锈钢设备/管路之间的连接均采用Steam-To阀。Steam-To 阀有可重复使用和一次性使用两种形式，如来自Neumo[6]的为可重复使用，来自Merck[7]的为一次性使用。Steam-To 阀的操作原理如图3所示。该阀门与工艺管道之间采用1½＂卫生型卡盘连接，阀芯与流体接触侧形成的盲端距离短（符合ASPE-BPE死角<2D），满足CIP和SIP标准。从而，所有一次性管路与不锈钢管路之间的对接均可以实现卫生级连接，达到功能性密闭系统的标准[8]。在Steam-To阀与不锈钢管路安装连接后，阀芯将在关闭状态下被蒸汽灭菌，以确保连接过程的卫生级别，然后才能开始工艺过程。工艺过程之后，首先关闭Steam-To阀，然后清洗不锈钢管路，之后才能断开阀门，以确保阀门拆卸时产品不会暴露于操作环境。
按以上描述的混合式系统方式，深层过滤系统由两部分组成，具备完整CIP/SIP功能的不锈钢模块部分，以及抛弃型膜包组件部分。不锈钢模块部分包含了主要的产品流路以及自动化控制所需的仪表和阀门。深层过滤的过滤组件是抛弃型膜包，安装在可移动的POD膜包夹具[4]上。所用的除菌级过滤器为可抛弃型的囊式过滤器，该过滤器也可以安装在靠近收获袋的位置。两种过滤器均通过Steam-To阀和软管连接至不锈钢管路。由于深层过滤系统的尺寸较大，在厂房设计时就必需考虑到占地面积问题，比如生产规模的膜包夹具尺寸约为220 cm×90 cm（长×宽）。图4为上海奥星制药技术装备有限公司设计的一套简洁、紧凑的深层过滤系统，其膜包夹具设计在系统框架结构的下方，这样系统的占地面积大大减少。安装和拆卸膜包时，夹具需要从系统框架下移出来。

结论
当前许多商业化单抗生产项目采用2 000 L规模一次性生物反应器。在大多数项目中，虽然采用一次性生物反应器，但初步收获澄清是通过离心机离心完成的，而离心机是不锈钢设备。通常由用户自行完成一次性使用系统/部件与不锈钢系统/部件之间的安装和对接，但这种集成方式是不理想的。
与这种自行设计的设备集成方式不同，本文所述的用于单抗收获澄清的高度集成化的混合式系统，具有以下特点和优势：
将工艺罐设计为多功能罐，收获房间所需设备数量更少；
跨房间的料液转移管路为不锈钢管路，不需要每批生产时在房间里操作很长的软管；
不锈钢系统更容易满足深层过滤膜包冲洗时对WFI大用量/高流量的需求；
所有与产品接触的不锈钢设备/管路均具有CIP和SIP功能；
通过Steam-To阀进行卫生级连接，实现了功能性密闭系统；
该系统具有高度的自动化水平，仅一次性过滤组件的连接和断开是手动操作；
交接面和供应商的数量也降到最少，只需要两个供应商，一个负责离心机，另一个负责工艺罐、深层过滤系统和所有的不锈钢管路。
本文所描述的基本思路还可以灵活地适应工艺需求的变化。文中描述的混合式系统是一个很好的案例，说明通过不锈钢技术和一次性技术的完美结合，能够实现可靠、灵活并且高性价比的解决方案。

【参考文献】
[1] Sinclair A., Hybrid Bioprocessing: A Q&A with Andrew Sinclair, Process  Development Forum, June 28, 2017.
[2] Schmid R., Wieschelka S., Wagner R., Single-Use Depth Filters, Application in Clarifying Industrial Cell Cultures, Bioprocess International, 2017.01.
[3]Purity is key, Pharmaceutical and biotech production with GEA centrifuges, Brochure GEA Germany, 2016.
[4] Millistak+ Pod disposable depth filter system, Data Sheet, Merck KgaA Germany, Ver.10.0, 2018.03.
[5] Expert Solutions for Biopharma Applications, Brochure Quattroflow Fluid Systems Germany, 2018.
[6] "Single seat valve-aseptic"Data Sheet Neumo Germany, https://gb.rieger-ventile-valves.com/Single-Seat-Valve/2-2-26--.html.
[7] Lynx ST Connectors, Data Sheet, Merck KgaA Germany, Rev.7, 2018.01.
[8] ISPE Baseline® Pharmaceutical Engineering Guide, Volume 6 – Biopharmaceutical Manufacturing Facilities, International Society for Pharmaceutical Manufacturing (ISPE), Second Edition, 2013.12.

本文作者Wilfried Kappel系独立顾问；孙仁峰系重庆智翔金泰生物制药有限公司技术部经理；乌日图牧仁系重庆智翔金泰生物制药有限公司原液工艺负责人。