本文介绍了一种全新的层析澄清策略——用于单抗纯化的精细澄清阶段，可以有效去除影响Protein A层析捕获性能的可溶和不可溶杂质，达到提高Protein A层析性能的作用，从而促使单抗生产工艺向平台化和精简化发展。

生物制药产品在开发的所有阶段使用平台化的生产工艺，可以极大的缩短生物制药候选产品从研发到临床再到商业化的时间周期。对于单抗产品，这就意味着需要稳健的和高性能的Protein A亲和层析。然而，整个行业还是面临着Protein A亲和层析后纯度和再现性呈不稳定、多变性的挑战。现阶段单抗纯化工艺流程如上图所示：
单抗纯化整个工艺流程中，仅仅通过Protein A亲和层析这一步，即可以获得纯度很高的产品。然而，相比理想模型系统中亲和层析可以达到99.9-99.99%的纯度，现阶段由于单抗产品的高效价和高密度影响，Protein A亲和层析只可以达到95-98%的纯度。而这种现象在亲和层析阶段都普遍存在，因此，这就要求在亲和层析工艺后，增加精制层析步骤，以便获得更高纯度的产品。Protein A亲和层析性能的多变性严重限制了单抗纯化工艺的平台化进程，从而延长了单抗产品从研发到临床的时间周期，进一步限制了单抗产品商业化的进程。这里介绍了一种策略，具有很强的操控性，可以很好的提高Protein A层析后的纯度，简言之，即通过层析澄清的方式去除Protein A中的杂质，从而得到高纯度的Protein A洗脱液。

采用3M EmphazeTM AEX复合澄清膜进行层析澄清
传统的澄清过滤依赖于深层过滤来去除细胞和其他的不溶杂质，这种方式的最大限制在于不能去除像DNA/蛋白质-核染色质复合物等这种可溶性杂质。研究表明，细胞培养液中高浓度的核染色质被认为是影响Protein A层析柱性能的一种主要成分，在纯化工艺的很多阶段它扮演着催化沉淀的角色[1,2］。为了解决可溶性蛋白的去除问题，我们引入3M EmphazeTM AEX用于澄清过滤中精细过滤阶段，3M EmphazeTM AEX是一种全合成澄清膜，依赖拥有高载量的Q-功能基团的水凝胶和0.2μm的滤膜，在纯化工艺的澄清阶段高效率地去除可溶和不可溶杂质[3,4］。

澄清效果分析
采用动态光散射（NANO-Flex, Microtrac, USA）分析技术来表征传统深层过滤和层析澄清技术滤液的特性，结果显示层析澄清可以得到更高澄清度和更高纯度的滤出液。事实上，层析澄清策略创造了一种单抗产品占主导的工艺流程，这种策略明显增强了Protein A层析柱从HCP杂质中分离单抗的性能[4]。

Protein A后产品纯度和病毒灭活后的稳固性
采用两种不同澄清方式的滤液，通过标准的Protein A层析柱进行纯化，结果表明，层析澄清方式明显增强了Protein A 层析柱的捕获性能，得到了HCP/DNA含量较低的高纯度产品。Protein A洗脱液纯度的提高，极大的降低了病毒灭活中和液（VIN）的浊度。结果表明，Protein A洗脱液纯度的提高也增强了VIN的稳固性，很好的提高了工艺的操控性和简化了工艺流程。这就意味着可以省略到VIN后的深层过滤步骤，从而减少了产品的损失。

结论
这项工作展示了采用3M EmphazeTM AEX复合澄清膜技术应用于蛋白纯化工艺的一种新策略。这种新策略可以高效的去除干扰Protein A层析性能的可溶和不可溶杂质，因此可以同时实现澄清和纯化两个目的；另一方面，这种性能的提高直接影响到下游亲和层析后纯度的提高和病毒灭活中和液浊度的降低。另外，这种策略对于单抗纯化工艺具有巨大的意义，可以使纯化流程平台化和精简化，而这种策略更大的意义在于，在单抗产品开发的任何阶段和生产的任何规模都可以使用3M ZetaPlusTM和EmphazeTM AEX平台的不同规格产品，对整个工艺流程进行整改和优化，从而达到最优化的目的。
最后特别感谢FUJIFILM Diosynth Biotechnologies U. S. A对于该研究内容的支持。
【参考文献】
[1]Emerging Challenges to Protein A, P. Gagnon, Bioprocess International, 2013.
[2]Nonspecific interactions of chromatin with immunoglobulin G and Protein A, and their impact on purification performance, P. Gagnont et. Al, Journal of Chromatography A, 2014.
[3]Anion-Exchange Chromatographic Clarification: Bringing simplification, Robustness, and savings to mAb Purification, A. Castro-Forero., et. al., Bioprocess International, 2015.06.
[4]Development of the Next Generation  Purification Platforms Through Novel technologies and Holistic Process Engineering Approaches, A. M. Voloshin, BPI West, 2016.03, Oakland, USA.