新的测试标准帮助用户发现有滤出风险的薄

一次性生物反应器是实验室和生产过程中的标准型设备，其使用简单、快捷、洁净，但同时也存在一定的风险，比如可以溶出的一次性袋子塑料薄膜能够进入培养基中，阻碍细胞的生长。迄今为止一直没有成功鉴别有害薄膜溶出的测试方法。本文介绍的一系列实验测试或许能够改变这一状况。

●一次性技术和装备已经是生物药品生产过程中经常会用到的技术和装备了。但这一系统始终有着自己的缺点和应用限制，其中最大的难点就是所谓的溶出物/ 析出物问题。

创造真实可比性的测试实验方法基于溶出物和析出物的不利影响，专业人士主张哺乳动物细胞培养的筛选是对现行提取研究的有利辅助和帮助。这一方法能够帮助及早发现有害的膜溶出物，改善一次性袋的质量监控，简化它们的工作使用。目前，各个用户在使用一次性袋时的这种细胞测试使用的都是自己的细胞、自己的培养基，按照自己制定的操作步骤进行测试，因此测试的结果之间基本上没有可比性，不能用于不同膜的使用建议。

这里所缺少的就是一个标准的细胞培育测试方法，基于一种或者多种常用的敏感细胞，规定的化学培养基上统一的，满足最终用户大多数要求的测试方法。在这样的背景条件和开发标准的细胞培育测试方法的目的下，德国Dechema 化学工程与生物技术协会的临时工作组“生物制药过程中的一次性技术”工作组进行了两轮实验。

第一轮实验：找出溶出物的踪迹第一轮实验中，对7 家供应商不同新膜的一次性袋在5 个用户的6 种重组CHO细胞和6 种不同的化学培养基中进行了实验。实验时，每一个用户都用摇瓶按照自己合适的细胞测试方法进行了实验。实验时使用的培养基都是用培育WFI(注射液)制作的。在水萃取的同时，也在一次性袋中(充填量50%，温度37℃，7 天时间，静态，避光)放入了注入WFI 注射液的肖特瓶作为检测参照物。

实验结果是以检测参照物为100%这一基础来进行评判的。评判的重要参数有最大细胞密度、酸碱度pH 值、细胞大小、葡萄糖，谷氨酰胺，乳酸和氨浓度与培育时间的关系。在所有的用户和所有细胞进行的测试中，7 种新膜都得到了相同一致的数据。有两种膜的结果与参照物有一定的差别，对一种或者几种细胞培育生长严重的影响。因此可以怀疑这两种膜在实验条件下出现了溶出物。

很长时间以来，一次性反应器就是生物制药工业企业实验室和生产过程中的标准设备了。但它们也带来了看不见的风险，可以溶出的一次性袋子塑料薄膜能够进入培养基中，阻碍细胞的生长

第二轮实验：利用标准方法排除错误第二轮实验时对7 家供应商提供的11 种膜(部分膜与第一轮实验的不同)在4 家用户处的8 种CHO 细胞系和7 种化学培养基中进行了实验。实验中的一种膜是按照一次性袋供应商提供的负控制、阴性对照的方法进行实验的。

在实验中使用的细胞系中有一个细胞系是市场上常见的未重组细胞系(瑞士Cell Culture Technologies 公司的CHO-easyC)。其他的细胞系都是重组细胞。其中，苏黎世应用科技大学(ZHAW)除提供了未重组的细胞系之外还提供了SEAP(胎盘分泌的碱性磷酸酶)模型细胞系(CHO XM 111-10)。

与利用玻璃瓶中的WFI 注射液萃取进行评判不同，这次实验时把膜和评判参照物一起直接放入测试仪中进行测试了。测试仪利用从袋中萃取的细胞培养液逐点(在3 台测试仪对4 种细胞系)用萃取的WFI 注射液进行测试。在袋中的水萃取和培养基萃取的同时还在培育瓶中对WFI 注射液和培养基进行了3 台的培育，作为参考对照物。为了提供实验结果的可比性，还规定了一些限制性的边界条件。

实验时使用的膜都是伽玛射线照射后两个月以内的膜(第一轮中有两种膜不是这种情况)。另外，所有测试实验中培养基的无菌过滤用的过滤器都是Merck Millipore 公司研发生产的PVDF膜过滤器“伽马射线兼容的Millipak-20过滤器， 过滤精度0.22 μm，6.3 英寸HB/ HB W /Bell”。

在评判第二轮实验的结果时，采用的评判标准如下：

● 没有或者有微不足道的偏差(k)：当检测到的细胞系没有偏差或者一个标准组的负偏差>10% 时;

● 标准偏差(m) ：当2 个或者3个标准组中的1 个被测细胞系或者3个标准组中的多个被测细胞系负偏差>10% 时;

● 强偏差(s)：当3~4标准组中的一个或者多个被测细胞系的偏差>10%时。

培养基与接触层的交互影响培养基的萃取液和WFI 注射液制成培养基萃取液检测结果之间存有差异并不是不可理解的。其中的一个原因就是除了溶出物的参与之外还有一些像胆固醇和脂肪酸等也与疏水膜(接触面)相互作用，限制了细胞的生长、发育。不同的工作组在无血清的、无蛋白的特定化学成分的培养基中都发现了血清白蛋白作为蛋白质载体的现象。

第二轮实验结果的分析表明11 种被测膜中的4 种在参照组和培养基萃取物之间没有偏差或者只有可以忽略不计的偏差。有多种膜(假设与最大活细胞密度之间的偏差≤ 10% 时评定为+ ;第一轮实验时实现的最大活细胞偏差超过0% 被视为可以接受的)的细胞- 培养液组合液中，不仅可以排除溶出物的迁移，而且也可以排除培养液成分与膜的交互影响。用于WFI 注射用水有着很高的腐蚀性，因此基于水萃取的实验结果可以得出这样的结论，两种被测一次性袋由溶出物没有在细胞- 培养基组合液中产生污染及产生的污染可以忽略不计，而膜与培养液成分的相互作用则是造成萃取介质中等标准偏差的主要原因。

提出建议考虑到WFI 注射液水萃取和培养液萃取的检测结果，可以清楚评定3 种膜的溶出物进入到了培养液介质中，对细胞的生长产生了不利影响。因此这种测试系统就提供了基于CHO 细胞溶出物测试方法。在两种测试系统中，涉及到工业化产品测试方法是使用模型细胞系CHO XM 111-10。

这种基本培养基由大约50 个基体构成，并1993 年公布了其组成成分的原装FMX-8 基础培养基。这种基本培养基含有亚油酸，亚油酸与膜的交互作用能够解释说明：实验中萃取培养基中最大细胞数低于20% 的原因了。

根据这一系列的实验结果可知：CHO XM 111-10/ChoMasterR HP-1/ 系统是一种适合于对膜的溶出、析出进行测试的系统了。利用这一方法可以及早确定无蛋白或者特定化学培养基中CHO细胞无血清培育中的风险了。”