概述3M最新推出、用于单抗精制工艺中，新型的EmphazeTMAEX混合膜层析产品，主要介绍其基本结构和功能，重点介绍其应用在单抗纯化工艺上下游的优势和特点。

单克隆抗体(Monoclonal antibody，简称单抗)广泛应用于疾病的诊断和治疗，已占生物药品市场的20%(1)。而对于单抗产品的纯化，大体经过细胞培养液预处理、捕获层析、精制层析、病毒灭活和清除几大步骤，虽然柱层析是单抗产品纯化的主要方法，但因介质价格高，生产量低，操作复杂，不易于放大等因素，限制了他们的工业应用，因此一些更有效和更经济型的依赖于非色谱纯化技术如选择性沉淀、高选择性的液-液分离技术及膜层析技术也在兴起，而基于流穿模式的阴离子交换膜层析技术，被认为是单抗纯化工艺中Protein A后，替代精制柱层析的一种很好的选择(4.5)，而且膜层析技术可以更好的提高哺乳动物培养液中单抗产品的收率，使用过程简单，无需清洗，易于放大，越来越受到大家的青睐。

3M基于现有膜层析技术及自身技术研发平台，推出一款复合的、包含多种过滤介质及机理的膜层析产品EmphazeTM AEX，该产品由两部分组成，第一部分由四层包含内置Q-基团(季胺基团)、全合成的水凝胶介质组成(见图1)，该部分是整个产品的核心功能区，占产品总质量的2/3，从而确保该产品具有很强的阴离子交换功能;另一部分由纵向呈渐紧排布，包含9个区域，横跨20倍孔径范围的高分子膜组成，最底层区域为0.2μm的减菌膜(见图1)，可以有效去除颗粒杂质和降低微生物负荷。该产品广泛应用于蛋白纯化的上游除杂和下游精制纯化阶段，在保证目标蛋白高收率的同时，对哺乳动物培养过程及纯化过程中产生的HCP、DNA及颗粒杂质均有很好的去除效果。

适用于蛋白纯化上游

EmphazeTMAEX适用于蛋白纯化上游，可以替代传统的精制深层过滤，在显著降低浊度的基础上(出口浊度均<5 NTU)，可以大幅降低诸如DNA、HCP和生物负荷等杂质，其载量也与传统高精度深层过滤器相媲美。EmphazeTM AEX混合膜层析产品的内置Q-基团所带高密度正电荷，与传统深层过滤相比，能显著减少带负电荷的HCP和DNA，研究结果表明，当采用CHO离心液作为研究对象，起始浊度为84NTU，DNA浓度为1.60 x 108 pg/ml，HCP浓度为3.89 x 105 ng/mL，最终滤出液的HCP去除效果可以达到20-40%(见图2-1)，DNA对数下降值(LRV)均超过4个log降(见图2-2)。

在蛋白纯化工艺中多数采用亲和层析Protein A层析柱，因在使用过程中需要购买昂贵的层析柱和层析填料，所以在整个纯化工艺过程中对其的保护和优化成为大家越来越关注的问题。EmphazeTMAEX作用于Protein A层析柱前，能有效降低Protein A层析柱上样前的可溶性杂质，诸如DNA、HCP，从而极大提高Protein A层析柱的性能，因此允许采用更温和的层析柱清洗条件进行清洗，大大延长Protein A层析柱的使用寿命。试验结果显示，经过EmphazeTMAEX纯化后，在随后CIP阶段的滤液中，HCP含量仅为37ppm，含量低于传统深层过滤的17倍(图3-1);DNA含量为7.5pg/ml，含量低于传统深层过滤器的2.7 log(图3-2)，这意味着可以允许采用更温和的清洗条件进行Protein A层析柱的清洗，Jiang等人研究表明，清洗剂比如NaOH，在循环使用过程中会损失Protein A的柱容量(6)，因此更温和的清洗条件，意味着可以更好的保护Protein A层析柱，从而达到更好的经济效益。

EmphazeTM AEX混合膜层析产品整合了0.2 μm过滤膜的独特设计，可提供高于6个LRV的生物负荷的降低，并为下游除菌滤膜(包括减少支原体的0.1 μm除菌滤膜)提供绝佳保护。这也是降低细菌和支原体造成下游污染风险的经济型策略。

适用于单抗下游精制纯化

在单抗纯化下游，深层过滤主要用于去除pH回调后新产生的沉淀，新型产品EmphazeTM AEX在去除纯化工艺过程未去除杂质的同时，可同时发挥阴离子层析柱的功能。Rentschler等人基于以上机理，在单抗纯化工艺中，建立了一种新型的单步纯化工艺(图4)，可以直接省略掉以阴离子交换层析为目的的精制层析，直接采用EmphazeTM AEX一步替代，这种新型的两步纯化步骤在保持产品高品质，过程安全和稳定的同时，可以提高目标药物的总产量(3)。

EmphazeTM AEX可以作为附加或者替换阴离子交换层析柱而适用于下游，尤其是产品由于蛋白聚合体的存在而出现不同程度的浑浊时，可以将浊度有明显的降低，将浊度由原先较高的浊度，下降到5NTU以下，浊度下降值达到80%，并且可以将HCP含量，由原先的3000ppm下降到10ppm，将近300倍的去除效果(见图5)。

总结和展望 随着单抗在诊断与治疗中应用的快速发展，对单抗的种类及数量的需求越来越多，如何进行大规模的生产已成为抗体纯化的主要问题。由于容纳缓冲液及分离介质的容器容量限制等原因，目前抗体纯化的下游加工处理能力逐渐跟不上细胞培养量的提高。柱层析操作由于处理能力受限，同一批细胞培养物只能通过不断循环加工处理才能完成(1)。基于上述问题，3M创新性的继承和发展了非色谱纯化膜层析技术，在达到去除杂质的同时，又可以提高收率和应用于大生产，当然3M也会不断紧跟时代需求，开发出更多适用于单抗纯化的产品，满足人类对单抗不断提高的需求。

参考文献

(1) 单克隆抗体纯化研究进展，中国医药工业杂质，2008,39(10),777-781.

(2) C. Jiang, J. Liu, M. Rubacha & A. A. Shukla; A mechanistic study of protein A chromatography resin lifetime; Journal of Chromatography A 2009 , 1216, 5849-5855.

(3) Dr. Dethardt MÜller, Rentschler Biotechnologie GmbH, Laupheim; taking mAb purification to the next level; European Bioetchnology, Autumn 2014,13,76

(4) Zhou, J.X., Tressel, T. Membrane chromatography as a robust purification system for large-scale antibody production. Bioprocess Int. 2005, 3(9), Suppl. 32-37.

(5) Zhou, J.X., Tressel, T. Basic concepts in Q membrane chromatography as a robust purification unit for large-scale antibody production. Biotechnol. Prog. 2006, 22, 341 – 349.

(6) C. Jiang, J. Liu, M. Rubacha & A. A. Shukla; A mechanistic study of protein A chromatography resin lifetime; Journal of Chromatography A 2009 , 1216, 5849-5855.

图1 EmphazeTM AEX膜层析结构

图2-1 EmphazeTM AEX与传统深层过滤HCP去除效果对比

图2-2 EmphazeTM AEX与传统深层过滤DNA去除效果对比

图3-1 EmphazeTM AEX与传统深层过滤HCP去除效果对比

图3-2 EmphazeTM AEX与传统深层过率DNA去除效果对比

表1. Emphaze AEX减菌膜细菌挑战测试结果

图4 新型纯化工艺图

图5 EmphazeTM AEX对于浊度&HCP去除效果图