原料质量的鉴别是生物制药生产过程中一个重要组成部分，绝大多数次品或者废品都是由于使用了不正确或者质量较差的原料。本文通过对某家制药公司使用低品质原料制备的复合细胞培养缓冲液的实际案例进行分析，讨论了近红外光谱在原料鉴别方面的应用。

原料质量的鉴别是生物制药生产过程中一个重要组成部分，绝大多数次品或者废品都是由于使用了不正确或者质量较差的原料。为了避免这些不必要的昂贵花费，往往需要对原料进行严格地质量检测，筛选出不合格的原料。化学测试是一种常规的质量检测方法，但是这种方法需要将样品送到实验室进行测试分析，是一个相当复杂且费时费力的过程。与实验室化学分析相比，NIR（近红外光谱）是一种更简单、更快捷，并非常常用的分析检测方法。

化繁为简 性能卓越

生物制药产品是用生物或化学原料（如细胞培养的营养成分、血清、无机盐、洗涤剂、酶、生长素以及其他化合物）制成的。使用低质原料将导致生物制药产品达不到预期药效，甚至对人体有害。因此，绝大多数失败或者被召回的产品是由于使用了不正确或者质量较差的原料，这既损害了产品的品牌声誉，又增加了公司成本。

PAT（过程分析技术）是由FDA（美国食品药物监督管理局）所引进的监管标准，其目的是鼓励对药物开发及其生产过程进行连续实时监控，以保证药品的质量。过程分析技术的目标是了解和控制生产过程，虽然不能从产品内部直接测试质量，但建立质量监测系统还是必要的。

图1  用于定性分析的磷酸盐原料的特征光谱。尽管吸收峰差别不是非常大，但谱图中细微的差异还是能鉴别出不同类别的磷酸盐

使用实验室化学测试方法对原料质量进行评估已应用于制药界多年，这种方法需要将样品运到实验室进行分析。然而，由于制药行业都倾向于对来料进行100%地检测，因此从所有原料仓库中采集样品再送往实验室进行分析是极其耗时且昂贵的。此外，化学测试还涉及到一些复杂、艰难和冗长的步骤。FDA的过程分析技术监管标准明确规定：在产品进入市场之前，为了加强药物生产过程控制和产品质量验证，原料的在线分析是一个关键步骤。而近红外光谱可用于原料的在线监测，因此在生物加工方面，它是一种可行、有效的过程分析技术工具。

近红外分析提供的光谱信息可用于鉴别原料种类、确定原料质量以及定量测量原料中各种成分的含量。功能强大快速的近红外光谱仪尤其适合码头卸载时对原料进行分析，这样就省去了将试样送到实验室进行分析的复杂过程。近红外吸收光谱是由分子振动引起偶极矩变化而产生的。通常情况下，有机化合物在近红外光谱区振动比较活跃，而且碳原子和其他原子之间的化学键相对来说较容易分析，所以近红外光谱常被用于有机物的分析。因此，人们往往误认为该方法不适用于无机原料，比如无机盐的分析。确实，有一些无机盐的近红外吸收峰不强，但是更多的无机盐在近红外区域的振动非常活跃，因此使用近红外光谱也可以对它们进行正确的分析和测量。例如水合无机盐，尤其易于用近红外光谱分析。此外，这种方法还可以用于鉴别不同的多原子离子。从下面这个应用案例可以看到近红外光谱作为一种强大的分析方法，在鉴别和定量分析用于生产超高纯度细胞培养缓冲液的磷酸盐的方面，同样具有卓越的能力。

图2  校正曲线,即近红外预测的焦磷酸重百分数和实际焦磷酸重量百分数的关系（该图表明预测值和实际值之间具有良好的相关性以及较小的均方根误差）

快速准确地鉴别及定量

一家生物制药公司使用低质原料来制备复合细胞培养缓冲液，而标准的质量测试方法无法检测到这些不合格原料。最终，该公司由于成品损失、调查、回收以及名誉受损，总损失超过3亿美元。

使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）对已配制的细胞培养缓冲液进行更复杂的分析，鉴别出这些劣质原料是一批精制纯度不够的磷酸氢二钠（Na2HPO4）。具体来说，这些原料中含有大量的焦磷酸离子（P2O7）4-，这些焦磷酸离子会导致细胞培养液的错误配置，进而损坏生物反应器并使其运行失效。通过随后的近红外分析证明，如果使用近红外光谱仪，这些由供应商提供的低质原料可以在码头接收时就被快速、准确地鉴别及定量。

分析方法

本次分析通过使用一台近红外光谱分析仪（配有赛默科技公司的Antaris开发采样系统），成功地鉴别出不同类型的磷酸盐粉末，并且对磷酸氢二钠原料中焦磷酸盐的含量进行了定量分析。两个实验分别进行，以达到定性鉴别及定量测量这两个目的。

图3  预测残差平方和曲线符合一个稳健的化学计量学偏最小二乘法的理想行为，预测残差平方和曲线经过一个较小的因素值之后迅速下降，然后在最小值处稳定

定性鉴别

基于原料的用途和作为来料的潜在用途，6种不同的磷酸盐（见下表）被用于本次实验进行分析，这6种原料代表了从磷酸盐矿中提炼出来的各种矿物质。使用赛默科技公司的SabIR光纤探头直接对货箱中的磷酸盐进行装样，取16次扫描光谱的平均值进行分析，分辨率为8cm-1。在本次分析中，每种原料各取11份样品。

用赛默科技公司的TQ分析软件对光谱进行化学计量处理，使用正交信号对光程长度进行校正。考虑到样品反射的不同会引起基线漂移，因此对光谱的基线进行了线性消除处理（Multiplicative Signal Correction）。此外，原光谱在使用时无需进行预处理或偏差处理。本方法使用的光谱范围从7400~4100 cm-1。图1给出了每种磷酸盐的光谱。可以看到，这些试样中的吸收峰和光谱特征虽然差异不大，但许多强大的校正方法已应运而生。

定量测量

本次定量研究使用了13份含有无水焦磷酸钠的磷酸氢二钠（Na2HPO4）样品，其无水焦磷酸钠含量范围为0~15.4%（约含0~10%焦磷酸离子）。

这13份样品被收集在位于光谱仪积分球上的两个小瓶中。取64次扫描光谱的平均值进行分析、分辨率为8cm-1。通常，每个样品的光谱都采集两次，并且在化学计量分析中将两次采集的结果合并在一起。偏最小二乘法（PLS）可定量预测磷酸氢二钠中焦磷酸盐含量的百分比。除4种样品外，大多数样品都可以用于偏最小二乘法的化学计量校正模型的建立和开发，但这4种样品将被用作之后的验证标样，以测试校正模型的稳定性和可靠性。用Norris导数平滑法（段数11，间隔数5）对标样的光谱进行二阶导数预处理。分析的光谱范围为7400~4700cm-1。

结果分析

近红外光谱分析可以成功且准确无误地鉴别不同的原料。每种原料之间光谱差别足以将它们清楚地分开。马氏距离（Mahalanobis Distance）可用于表示每个光谱与类平均的差异程度。马氏距离较小表明样品光谱更接近类平均，而马氏距离较大表明样品光谱与类平均的差异较大。

理想情况下，通过每个光谱的最小马氏距离可以准确地判断样品类别，而下一个最高的马氏距离会相对较大。马氏距离可看作标准偏差，频谱从类平均处下降。马氏距离小于1表明频谱与类平均非常相似。图2列出了最接近不正确类与正确类的平均马氏距离的比值。比值大于3表明属于该类中的聚集光谱间有很大的分离度。可以看到，对焦磷酸钠的比值很大，这表明它与下一个最近材料的类别极为不同。

偏最小二乘法是从二阶导数光谱发展而来的，通过该方法能获得近红外预测值和测量的质量百分数之间的校正曲线，二者具有良好的相关性。焦磷酸离子质量百分数的校正曲线（见图2）证实了这种高度相关性。

除了具有高度相关性外，偏最小二乘法的误差也很小。均方根预测误差（RMSEP）来自用于预测偏最小二乘法稳定性的4种偏差标准，而校正均方根误差（RMSEC）是由用于开发均方根预测误差的标准计算而来。校正均方根误差和均方根预测误差的值分别为0.46%和0.68%。这表明，偏最小二乘法可以轻易地预测出磷酸氢二钠中焦磷酸盐污染物的含量在0~10%之间，检测结果精确度很高，平均误差小于0.75%。此外，预测残差平方和（PRESS）曲线也被用来评价该方法的质量。当分析方法中所用的因素值增大时，预测残差平方和曲线急剧下降至最小值，并保持恒定。图3表明预测残差平方和曲线遵循的理想模式，这说明偏最小二乘法是可靠的，并且具有良好的预测能力。这种方法应用于四因素的化学计量分析。

避免损失 方便省时

在生物加工过程中对原料的质量进行分析和鉴别，采用近红外光谱技术要优于实验室化学测试。近红外光谱是一种快速且易于操作的技术，可由非分析人员在码头接收产品时或生产过程中直接用于分析原料和产品的质量。在收货现场使用这种方法，药品制造商可以在原料使用之前鉴别出低质原料，避免产生巨额损失。

尽管缓冲液中常用的无机磷酸盐常被误认为在近红外光谱分析中没有显著的信号，但实验数据表明，近红外光谱技术可以很容易地鉴别出这些原料。当精制的磷酸氢二钠含有焦磷酸盐等污染物时，在其吸收区有明显差异，可以鉴别和区分这些成分。所以说，这是一种不用将样品带回实验室进行昂贵、耗时的分析，就可以迅速测定焦磷酸盐污染物含量的方法，预测的均方根误差小于0.68%。