0引言

随着我国人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)感染流行形势的日益严重，临床就诊的HIV感染者/AIDS(acquiredimmunodeficiencysyndrome)患者在逐步增多，临床治疗的压力越来越大[1].但由于我国治疗艾滋病的药物开发及研制工作滞后，故目前尚无疗效可靠，经济实用的药物.虽然世界上有公认的治疗艾滋病有效的高效抗逆转录酶病毒联合疗法(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)，由于价格昂贵且副作用极大[2-3]，难为我国患者广泛接受并长期应用.因此，研究和开发有效的传统中药防治艾滋病非常重要.

穿琥宁是从穿心莲叶中提取的一种纯中药制剂，属于一种低毒高效的抗病毒药.具有抗炎、抗病毒及清热解毒的作用，临床已广泛用于感染性疾病的治疗,尤其对病毒性疾病有较好的疗效[4-5].但穿琥宁对HIV/AIDS的作用报道很少,本研究用不同浓度的穿琥宁和H9/HIV1ⅢB作用观察其是否具有抗HIV1的作用.

1材料和方法

1.1材料中药穿琥宁粉针剂(哈尔滨二联药业有限公司)用PBS配制为100g/L存储液，无菌分装，-20℃贮存备用.AZT(叠氮胸苷)(3′Azido3′deoxythymidine)(美国BiochemikaFluka)100mg，用二甲亚砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)配成100g/L，分装-20℃贮存备用.药物存储液于实验前用RPMI1640培养基按需要稀释至所需工作浓度.钙黄绿素(CalceinAM，美国MolecularProbes)，用DMSO溶解配制成1mmol/L，分装，-20℃贮存备用.噻唑蓝 (MTT,Sigma)PBS配制5g/L，-20℃贮存备用.P24抗原检测试剂盒(美国ZeptoMetrix).RPMI1640培养液(美国 Gibco),配制时加入青霉素1×105U/L,链霉素100mg/L,过滤除菌，使用时加入100mL/L(V/V)胎牛血清(FBS).HIV1Ⅲ B感染的慢性H9细胞(H9/HIV1ⅢB)和MT2细胞来自美国，由南方医科大学免疫教研室惠赠.

1.2方法

1.2.1细胞和病毒培养H9/HIV1ⅢB细胞和MT2细胞用含100mL/L(V/V)FBS的RPMI1640培养基在37℃，50mL/LCO2培养箱培养，2～3d传代1次.进行药物实验前1d再传代换液1次使细胞处于对数生长期.

1.2.2穿琥宁对细胞的毒性测定采用MTT法[6]分别测定穿琥宁对MT2细胞和H9/HIV1ⅢB细胞毒性.观察细胞存活率和求出CC50浓度(50%cytotoxicconcentration，即对50%宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓度).细胞存活率=(实验组A均值 /对照组A均值)×100%).根据细胞存活率按照ReedMuench法求出CC50浓度.

1.2.3药物对H9/HIV1ⅢB细胞与MT2细胞早期融合的影响①H9/HIV1ⅢB细胞用分子荧光探针CalceinAM荧光染色：收集对数生长期的H9/HIV1ⅢB细胞，计数并配制4×108/L细胞悬液.按1mLH9/HIV1ⅢB细胞加入2.5μL1mmol /LCalceinAM.37℃孵育30min.PBS洗涤2次，再用含100mL/LFBS的RPMI1640培养液重悬细胞，再计数并调整细胞浓度为 4×108/L.②H9/HIV1ⅢB细胞和药物作用：将CalceinAM标记的H9/HIV1ⅢB细胞加到96孔板，每孔25μL细胞悬液.然后分别加入不同稀释度穿琥宁药物25μL，为实验组，另外设不加药物的病毒对照组，和加AZT药物阳性对照组.每种样本设3个复孔.37℃孵育30min.③细胞融合：每孔加入50μL处于对数生长期的MT2细胞(细胞浓度2×109/L)，同时设单独的MT2细胞对照(正常细胞对照).37℃孵育2h.在倒置荧光显微镜下观察细胞的融合，每孔随机计数4个视野，取均值.重复实验3次.计数不同稀释度药物的融合细胞数，并计算出融合细胞均数(N)值.融合抑制率 (%)=(1-实验组N值/对照组N值)×100.根据融合抑制率按照ReedMuench法算出 EC50(50%effectiveconcentration，为抑制合胞体形成达50%时的药物浓度).选择指数 (selectivityindex,SI)为CC50/EC50的比值.

1.2.4P24抗原检测和MTT试验检测药物对HIV1致感染细胞死亡的保护作用上述融合细胞计数后37℃再培养5d，离心96孔细胞培养板，吸取细胞培养上清做P24抗原检测(按试剂盒说明书进行)，细胞沉淀做MTT检测.HIV1体外感染MT2细胞后,在一定的时间内(5～7d)，感染细胞会死亡.用MTT方法测定存活细胞，酶标仪测定A值.待测药物与其共培养，如果抑制了细胞的死亡，活细胞数增加，或使p24抗原表达下降均说明该药物具有抗HIV活性.p24抗原抑制率=[1-(实验组A值/对照组A值)].保护率=(实验组A值-病毒对照组A值)/(MT2细胞对照组A值-病毒对照组A值).

2结果

2.1对细胞的毒性测定穿琥宁粉针剂对MT2细胞的CC50浓度为1798.5mg/L和对H9/HIV1ⅢB细胞CC50浓度为1199.4mg/L.

2.2细胞和病毒培养H9/HIV1ⅢB细胞整合有HIV1ⅢB，通常状态下，呈慢性整合感染状态，病毒较少释放出来，细胞表面可表达病毒蛋白.H9/HIV1ⅢB细胞呈圆形或不规则形，体积较小，细胞之间无融合出现.MT2细胞呈半贴壁生长，绝大部分为圆形或椭圆形，少数呈不规则状，体积较大，有极少数的大细胞存在.MT2细胞具有CD4受体.H9/HIV1ⅢB和MT2细胞混合后会融合成巨细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE,图1).

红箭头：融合细胞;黑箭头：未融合细胞.A：CalceinAM标记的H9/HIV1ⅢB细胞;B:H9/HIV1ⅢB和MT2混合培养细胞(荧光标记的病毒细胞对照组,显示较多的融合细胞);C：CHN抑制细胞融合.

图1H9/HIV1ⅢB与MT2细胞融合×250(略)

2.3对H9/HIV1ⅢB细胞与MT2细胞早期融合的影响在倒置荧光显微镜下观察H9/HIV1ⅢB细胞被CalceinAM染色后，能发出较强的绿色荧光，体积较小(图1A).单独的MT2细胞没有染色不能发出荧光.H9/HIV1ⅢB和MT2细胞共同孵育2h后，如发生融合，则MT2与H9/HIV1ⅢB融合细胞能发出荧光，但荧光强度弱于未融合的H9/HIV1ⅢB细胞(荧光素扩散到两个细胞)，细胞体积较大，因此很易区分融合和未融合细胞(图1B,C).穿琥宁药物能够较明显抑制H9/HIV1ⅢB细胞和MT2细胞形成合胞体，其EC50为5.49mg/L，选择指数SI 为327.6.AZT抑制细胞融合不明显，250mg/L的AZT仍然可导致多数的细胞融合(图2A).

2.4对HIV致感染细胞死亡的保护作用和对HIV1P24抗原表达的影响AZT和穿琥宁均能保护HIV1致感染细胞死亡和抑制 p24抗原表达(图2B，C).穿琥宁抑制HIV感染细胞死亡和抑制p24抗原表达的EC50分别为64.57mg/L和194.67mg/L，SI分别为27.85和9.23.

A:融合细胞抑制率(%);B：细胞保护率(%);C:p24抗原抑制率(%).药物浓度(mg/L)：AZT:1:250;2:25;3:2.5;4:0.25;5:0.025.CHN:1:1000;2:200;3:40;4:8;5:1.6.

3讨论

近年来，国内外有关抗病毒中药的研究日益增多，从中筛选其有效成分已成为当前抗病毒新药研发的一个热点.中医药是研究和开发新药的宝库，这类药物不良反应相对较小，可长期服用,而且我国的中药资源极为丰富，研究和使用的历史悠久，且价格低廉，效果明显，易于普及，因此从传统药物和天然资源中寻找有效的抗HIV药物是医药科研工作者今后相当长时间内的迫切任务[7].

穿琥宁粉针剂是由爵床科植物穿心莲叶中提取有效成分穿心莲内酯，再半合成为脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯钾钠盐,配制而成的无菌冻干品，其有效成分是穿心莲和琥珀酸.穿心莲能清热解毒，抑制细菌和病毒，琥珀酸能镇静安神、活血化瘀.病毒灭活实验表明,穿琥宁对对流感病毒甲Ⅰ型,甲Ⅲ型、肺炎腺病毒(Adv)Ⅲ型,肠合胞病毒及呼吸道合胞病毒(Rsv)均有灭活作用,对金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等11种细菌有抑制作用.该药还有明显的解热、抗炎、促肾上腺皮质功能及镇静作用,可增强血液中中性粒细胞、巨噬细胞的吞噬能力,提高血清溶菌酶的含量.穿琥宁抗病毒作用强,抗菌谱广，目前已广泛用于治疗病毒性肺炎、呼吸道感染、急性扁桃腺炎、轮状病毒性肠炎及病毒性心肌炎等,有较满意的疗效[4-5,8].本实验结果显示穿琥宁粉针剂在一定浓度范围内(8～1000mg/L)能够较明显抑制H9/HIV1ⅢB和MT2细胞形成合胞体，而且能够保护HIV感染细胞的死亡，减少HIV1P24抗原的表达.穿琥宁抗HIV1的作用机制可能是多途径的,可能有直接灭活病毒的作用,或者对吸附于细胞表面和进入细胞内的病毒有抑制作用.本实验结果为穿琥宁用于AIDS的治疗和预防提供了实验依据，而且穿琥宁的价格便宜，毒副作用低，在AIDS的防治中将可能有广阔的应用前景.