近年来,随着一些重大药害事件的逐渐披露,公众对于注射剂的质量问题越来越关注。药品监管部门也出台了一些列措施来提高注射剂的安全性控制标准。在国外出现了使用TbrN制剂的肾功能障碍患者出现铝毒性(中枢神经系统或骨)的报道[1],日本药典附录中收载了中心静脉肠外营养输液(TotalbrarenteralNutrition,TbrN)中微量铝元素的测定方法的内容。从2004年7月起[2],FDA要求生产厂家对大多数肠外营养液中的铝进行定量。大容积的注射用溶液,如葡萄糖、氨基酸、脂肪乳和注射用蒸馏水,要求其铝含量低于25μg/L;但对小溶剂的注射用溶液,如电解质、维生素和微量元素,则没有规定铝含量的上限。肠外营养液中的铝肠外营养液中并没有补入铝的要求,其中存在的铝属于一种药品污染[3]。

鉴于目前国内营养输液在外科术后康复和肿瘤辅助治疗中应用越来越广泛,而相关“微量铝污染”的质量控制手段尚未见报道,故将《日本药局方第十五改正版》(日文版)(以下简称:日本药典)中“参考情報:16中心靜脈栄養剤中の微量アルミニウム試験法”相关内容翻译介绍,供国内同行参考,以进行相关的防治和检控工作。

一、日本药典微量铝检测方法[1]

现有的微量铝分析方法主要有:1)荧光检测HbrLC法,2)电感耦合等离子体发射光谱法(ICbr-AES)和3)ICbr- MS等。荧光检测HbrLC法的检测灵敏度约为1μg/L(ppb)。如使用特别的附属装置ICbr-AES法和ICbr-MS法可以得到更高的检测灵敏度。由于TbrN是营养剂,含有糖类、氨基酸类、电解质等多样的营养成分,组成很复杂。由于这些成分对测定有着很大的影响,所以要特别注意根据产品的情况选择合适的分析方法。

考虑到作为分离分析方法的高效液相色谱目前应用很普及,日本药典选用了使用2种荧光性螯和试剂的荧光检测HbrLC法作为TbrN微量铝检测方法:1)羟基喹啉(quinolinol)螯合物法,和2)荧光镓(lumogallion)螯合物法。

(1)羟基喹啉螯合物法

在供试液中形成铝离子的羟基喹啉螯合物,采用荧光诱导的液体高效液相法进行试验。

供试液的配制

正确量取试验样品液(TbrN制剂)1mL,加水10μL,再加流动相至10mL,作为供试品溶液。

标准曲线系列标准液的配制

分别正确量取铝试验用水1mL,正确加入铝标准溶液(1)~(5)各10μL,加流动相至10mL,作为标准曲线系列标准液(铝离子浓度:0,1.25,2.5,5.0及10.0ppb)。

标准试验法

分别正确取供试品溶液和标准曲线系列标准液0.1mL,按照以下条件进行高效液相法试验。

采用标准曲线法,计算供试品溶液中的铝浓度。

试验条件

检测器:荧光光度计(激发波长:380nm,荧光波长520nm)

色谱柱:内径4.6mm,长度15cm的不锈钢管,填充物为液相色谱用苯基键合硅胶。

柱温:40℃附近恒定

流动相:8-羟基喹啉的乙腈溶液(3→100)/稀释的0.5mol/L醋酸胺试液(2→5)混合溶液(1:1)

流速:调整使铝/羟基喹啉螯合物的峰保留时间约为9分钟。

系统适用性

采用标准曲线系列标准液做成的标准曲线的相关系数在0.99以上。

也可以采用不在流动相中加入8-羟基喹啉,而在供试品溶液配制阶段加入8-羟基喹啉,使生成铝/羟基喹啉螯合物之后,再进行荧光检测的液体高效液相色谱试验。由于流动相中不含有螯合试剂,必须要预先生成更稳定的铝/羟基喹啉螯合物。还有,由于荧光检测的分析波长不同(激发波长:370nm,荧光波长504nm),测定的灵敏度也有所差异,检测用标准曲线应在0~25ppb的范围内适当选择。另外,由于色谱柱的尺寸、柱温以及流动相的组成也不相同,为了正确测定供试品溶液中的微量的铝,一定要认真选择适当的试验条件。

(2)荧光镓(lumogallion)螯合物法

在供试液中形成铝离子的荧光镓螯合物,采用荧光诱导的液体高效液相法进行试验。

供试液的配制

正确量取试验样品液(TbrN制剂)70μl,正确加入盐酸荧光镓溶液0.15mL之后,正确加入铝试验用pH缓冲液0.6ml。混合液在40℃放置4小时后,作为供试品溶液。

标准曲线系列标准液的配制

分别正确量取铝标准溶液(1)~(5)各1mL,加入稀释后的铝试验用硝酸(1→100)至100mL。从中正确量取70μL,正确加入盐酸荧光镓溶液0.15mL和pH7.2的铝试验用缓冲液0.6mL,混合后,在40℃放置4小时,作为标准曲线系列标准液(铝离子浓度:0,1.07,2.13,4.27及8.54ppb)。

标准试验法

分别正确取供试品溶液和标准曲线系列标准液0.1mL,按照以下条件进行液体高效液相法试验,采用标准曲线法,计算供试品溶液中的铝浓度。

试验条件

检测器:荧光光度计(激发波长:505nm,荧光波长574nm)

色谱柱:内径6.0mm,长度10cm的不锈钢管,填充物为液相色谱用辛烷基键合硅胶。

柱温:40℃附近恒定

流动相:向100mL2-丙醇中加入稀释的pH5.0的1mol/L醋酸·醋酸钠缓冲液(1→10)到1000mL。

流速:调整使铝/荧光镓螯合物的峰保留时间约为5分钟。

系统适用性

采用标准曲线系列标准液做成的标准曲线的相关系数在0.99以上。

二、相关注意事项[1]

1)实验中使用的水以及其他的试验用溶媒、试剂、器具等,均应选择铝污染小的产品,除此之外,也应注意实验室环境中的尘埃的铝污染。

2)检测前一定要注意检测样品的自身特性对鳌合物的形成不存在影响。

3)日本分析化学协会目前可以提供已知铝浓度的金属成分分析用河川水标准物质,在试验方法和实验结果的适用性评价时,可以使用这些标准物质。

三、标准溶液及试剂、试液的配制[1]

本实验中,除日本药典规定试剂之外,应使用以下的标准溶液和试剂、试液。

铝标准溶液取一定量的铝试验用水或铝标准原液,用稀释后的铝试验用硝酸(1→100)稀释,分别配制铝浓度为0,1.25,2.5,5.0及10.0ppm的铝标准溶液(1)~(5)。

铝试验用水除满足“精制水”的要求外,铝浓度应低于1ppb。

铝试验用硝酸硝酸中的铝浓度应低于1ppb。

铝试验用缓冲液取pH7.2的N,N-bis(2-羟基乙基)-2-氨基乙基亚磺酸106.6g,溶解于铝试验用水800mL后,加入铝试验用氢氧化四甲基铵调节pH至7.2,加铝试验用水至1000mL。

N,N-bis(2-羟基乙基)-2-氨基乙基亚磺酸C6H15NO5S白色结晶或粉末。

铝试验用氢氧化四甲基铵(CH3)4NOH铝试验用约为25%的水溶液,但铝浓度应在10ppb以下。

荧光镓盐酸溶液取荧光镓0.86g溶解于2-丙醇300mL中,正确加入稀释的铝试验用盐酸(9→50)350mL和铝试验用水至1000mL。

荧光镓(2,2',4'-Trihydroxy-5-chloroazobenzene-3-sulfonicAcid

4-Chloro-6-(2,4-dihydroxyphenylazo)-1-phenol-2-sulfonicAcid,译者注)

C12H9ClN2O6S红褐色~暗褐色的粉末。其中铝浓度应低于1ppm。

铝试验用盐酸盐酸中的铝浓度应低于1ppb。

四、小结与展望

FDA确定摄入铝5μg/(kg·d)是安全的,肠外营养液中的铝毒性是因使用含铝的肠外营养成分,最终造成铝在人体内蓄积引起的[4]。

Smith等进行的研究表明,肠外营养液中铝的主要来源为钙和磷酸盐,如葡萄糖酸钙、磷酸氢二钾、醋酸钠中的铝占到了肠外营养液样品中铝总量的90% [5]。对国外通常使用的肠外营养输液的研究显示,不同厂家的同一产品的铝含量是不同的,同一厂家的不同规格的产品铝含量也是不同的[5]。有文献报道, 更换肠外营养液的包装,减少玻璃容器的使用,可以起到预防的作用。1999年7月在德国上市的聚乙烯安瓿装葡萄糖酸钙可明显降低肠外营养液中铝的含量。使用聚乙烯安瓿替代玻璃容器分装葡萄糖酸钙,可使葡萄糖酸钙中平均铝浓度减少了96%(从5000g/L降到195μg/L)[6]。目前,聚乙烯安瓿装的葡萄糖酸钙只有德国使用。

对注射液中铝的安全性控制,目前国内药学领域报道较少,微量铝的测定研究多见于环境水体监测,国家药典标准尚未收载注射剂中微量铝的检查方法。希望国内医药产业界和监管部门联合起来,从外科大容量营养注射液产品的原料药质控、包材选择和质检方法等领域着手,进一步提升此类药品的整体品质。