1， 两种灭菌方法

蒸汽-湿热灭菌工艺开发和应用，可采用两种方法：过度杀灭法(the overkill method)和生物负载法(the bioburden method)。生物负载法也可称为存活概率法。

1.1 过度杀灭法

工业上蒸汽灭菌周期的设定和应用，一般使用过度杀灭法(the overkill method)。使用过度杀灭法的目标是确保达到一定程度的无菌保证，而不管装载物的实际负载生物的数量多少和抗热性如何。假定生物负载的数量和耐热值设为如下水平：

N0=106

D121=1分钟

Z=10℃

为了达到无菌保证水平SAL小于10-6，NF=10-6，利用上面这些数值，可以计算出为达到致死率所需的FPHY和FBIO如下：

F0=D121×(LogN0-Log NF)=12分钟

很少发现自然生成的微生物拥有超过0.5分钟的D121值。过度杀灭法假设的生物负载数量和抵抗力都要高于实际。大多数微生物的耐热性都要比这低，因此能够提供很高程度的无菌保证。

即便采用蒸汽-湿热灭菌工艺为过度杀灭法(the overkill method)，仍然需要对被灭菌产品的初始菌进行周期监测，并定期采用生物指示剂测试。

1.2 生物负载法

通常来说不耐热产品或物品的灭菌就不能使用过度杀灭法了。这就需要我们所建立的灭菌周期必须能恰当地杀灭微生物负载，但是不能导致不可接受的产品分解。这样的灭菌周期的建立就有赖于研究产品上的微生物数量和耐热能力。一旦微生物负载的数量和耐热能力得以明确，就可以设计出一个能达到SAL小于 10-6的灭菌周期。

按CGMP规范生产的产品实际生物负载数量应该是很低的，每个包装约在1～100CFU，对产品给予80～100℃下10～15分钟热休克，可以杀灭耐热值低的微生物。例如：

产品的生物负载测试中，测得：

N0=102

D121=1分钟

Z=10℃

则达到无菌保证水平SAL小于10-6，NF=10-6，利用上面这些数值，可以计算出为达到致死率所需的FPHY和FBIO如下：

F0=D121×(LogN0-Log NF)=8分钟

生物负载法需有实测产品活菌计数和耐热性筛选程序。必须取得足够的有关生物负载数据，亦建立历史资料。对生物负载筛选次数的要求，取决于历史资料的质量和变化情况，被灭菌产品的种类、生产工艺和灭菌工艺的类型等等。若生产环境发生了变化，应考虑对生物负载进行补充监测。

对生物负载耐热性的测定，可将含生物负载产品样本在推荐灭菌工艺下作分级递增暴露时间处理，然后进行无菌检查试验，以测定在不同的暴露时间内存活的菌量，或存在的阳性样本比例。作为一种替代方法，生物负载微生物的耐热性可通过分离和繁殖，随后接种在产品上或适当载体上进行测定。不过，要注意繁殖会改变生物负载的抗性。此外，还应对常规生物负载的微生物耐热性进行测定。

就生物负载而论，具有湿热高度耐热性的微生物菌株有：生胞梭菌(Clostridium sporogenes)，凝结芽孢杆菌(Becillus coagulans)，枯草芽孢杆菌和嗜热芽孢杆菌等。

以生物负载法为依据的灭菌工艺，需经常进行微生物筛选，以测定与产品有关的生物负载数量和种类。在常规生产中，应从每一种生产设备中抽取具有代表性的产品样本，并设计生物负载监测程序，对产品部件及生产中，包括环境和生产过程中，任何可明显地影响生物负载地变化进行评定。

2， 用于注射剂生产的辅助物料的灭菌工艺

用于注射剂生产的部分辅助物料在生产过程中与药品直接接触，因此同样需要灭菌。它们包括：过滤器、胶塞、胶管、服装、不锈钢器皿、填充机械部件、清洁用品等等。一般通过与饱和蒸汽直接接触而实现灭活，湿热蒸汽的能量通过传导或对流作用传递热量。常用方法是建立能够提供相同的最小灭菌保证水平的标准周期，再加上一定的安全系数，不管装载物的内容是什么。

对于这类物品，获得可重复和可预测无菌保证的最大障碍是物品中潜在的空气，所以适合的灭菌过程是先采用预真空过程，然后饱和蒸汽灭菌的方法。预真空过程的效果明显优于重力置换过程。

对于预真空灭菌程序，灭菌过程开始之前对装载物的处理是很重要的。如果每次的真空度为0.1个大气压，那么每个脉冲将使灭菌器内的空气减少90%或者 1个对数单位。可以增加为三个真空脉冲(蒸汽注入高于大气压，以避免空气进入灭菌腔室)，使装载物处于正常状态。通过这个方法，空气去除的效率会提高，平衡时间会缩短。

典型的重力置换程序建立在如下的理论基础上：腔室中的冷空气重于进入的蒸汽并且将沉降到腔室的底部。蒸汽进入腔室的时候，空气和冷凝液一起从腔室底部的蒸汽疏水阀排出。去除空气过程的成功取决于对蒸汽疏水阀的准确操作和合适的蒸汽分布。蒸汽一般通过导流板或多孔管注入灭菌器腔室，如果蒸汽增加得过于迅速或者没有合理分布，装载物的顶部附近可能会产生气穴，如果蒸汽增加得过于缓慢，空气可能会被加热而混入蒸汽中，从而使空气去除更加困难。重力置换去除空气的效率低于其他方法，不推荐用于空气去除困难的物品。

对于多孔/坚硬物品的灭菌，需要确定以下操作参数(但不仅限于此)：

灭菌程序阶段 对参数的说明

灭菌程序全部 外壳温度/压力 外壳温度不能超过或者明显低于灭菌器腔室的灭菌温度。要控制温度避免过度加热或过度冷却。

监控探头记录探头

必须独立，并带有合适尺寸的记录纸以便记录灭菌程序全部的温度压力变化值

加热阶段

真空脉冲的次数、范围和持续时间(若使用)

用于多孔坚硬物品灭菌时的空气去除

正压力脉冲的次数、范围和持续时间(若使用)

用于在灭菌程序开始之前控制装载物

腔室加热

对于饱和蒸汽的灭菌方法，可以根据温度和压力的变化设置报警点

灭菌阶段

灭菌时间

对每个灭菌程序都是重要的控制参数

灭菌阶段的温度

对每个灭菌程序都是重要的控制参数

灭菌阶段的腔室温度波动

对每个灭菌程序都是重要的控制参数

值的累积

对于灭菌器自带的测量探头，最小值的记录有利于灭菌程序的评价

冷却阶段

干燥时间

可以选择加热、真空等手段来干燥装载物

真空解除速率

若需要，可以用来保护包装或过滤器的完整性

若最后采用喷淋水降温，则必须监控喷淋水的质量。但是多孔/坚硬物质不适合采用喷淋水降温，一般采用抽真空或夹套降温。比如过滤器，胶塞，胶管，服装，不锈钢器皿，填充机械配件，清洁用品等等。

对于灭菌装载方式，需要注意以下几点：

 装载物的类型和结构要加以确认并记录在案;

 装载物不能接触到灭菌舱室内壁;

 金属箱表面与底座之间的接触应减小到最低程度，通常使用有孔的支架，必要时也可以用可调节的支架;

 为了便于空气去除，冷凝水排出和蒸汽穿透，要明确地确定装载物地方位并记录在案;

 质量大的装载物应放置在灭菌器中较低的架子上，以尽量减少被冷凝水弄湿;

 控制灭菌器中物品的数量，如果装载物的大小能够改变，则需要确定最小和最大的装载物，确认中间装载物的合理插入法应包括最低负载中的最难灭菌物品;

 如果确认研究表明物品的位置不影响灭菌效果，那么装载的形式可能是可变的;

 装载记录可以作为操作人员的参考。

4， 灭菌验证的方法

灭菌过程的验证和常规控制的相关内容包括灭菌设备的确认、灭菌工艺的验证、包装适用性、装载试验、空气过滤器的检查、蒸汽的质量及管理、真空检查和再验证周期等等内容。

4.1 在蒸汽灭菌验证进行之前，需要确认以下内容：

蒸汽灭菌器制造商的质量保证、

蒸汽灭菌器的检查、安装和性能确认、

安装于蒸汽灭菌器的空气过滤器的泄漏试验、

空气流速或流型试验(若必需)、

压力或真空度测试、

蒸汽质量测试(若必需)、

生物指示剂(化学指示剂)的挑战性试验、

不同装载的验证、

升温时间的控制(若必需)、

保温时间内的温度波动范围、

对灭菌器进行热分布/热穿透测试仪器的校准，

IQ/OQ/PQ的方案

具备证实能够进行IQ、OQ和PQ的所有内容并能对偏差进行处理及纠正的能力。

4.2 一般来说：验证(IQ/OQ/PQ)必须包含：

4.2.1被测灭菌设备和公用系统的测试必须包含：

1.1 灭菌设备供应商的评价;

1.2 灭菌设备的容积、真空度、压力以及泄漏率;

1.3 用什么作为灭菌介质(如蒸汽、高压空气、过热水等)并能证实有效;

1.4 灭菌设备如有夹层、夹层与气室之间的压力与温度保持在什么水平上是安全的;

1.5 使用何种类型的过滤器?多长时间进行挑战性试验?

1.6 使用何种类型的监测和控制传感器?如何校正?是否符合相关规定?

1.7 如灭菌设备中装有蒸汽分流器，则必须消除系统运行安全的风险;

1.8 时间、温度、压力、压力消减速率的控制(若必需);

1.9 空气质量、水质量的控制以及报警(若必需);

1.10 以上所有情况的变化是否评价再验证的必要;

4.2.2 对灭菌工艺的验证必须包含：

2.1 空载热分布研究

2.2 热穿透研究

每种装载容器的每种装载方式;

每种方式的运行次数;

每种方式的冷点是否确定;

2.3 升温、降温速度对生产工艺、产品的影响;

2.4 喷淋冷却速度对被灭菌产品的影响;

2.5 冷却用水是否能有效地控制微生物;

2.6 温度测量系统是否提供每一个测点的打印数据;

2.7 温度测量系统是否每次运行都进行前后校正;

2.8 温度测量系统的校正是否符合相关规定;

2.9 生物指示剂的使用：

类型;

来源;

密度和D值;

是否采用生物负载法?是否测试被灭菌产品的初始菌?

如发生意外(阳性)，如何处理;

2.10 若出现热穿透偏差如何处理;

2.11 若必需，提供污染菌(微生物负载)的特性及鉴别;微生物负载的报警及采取措施的限度;生物指示剂的鉴别、耐热性及稳定性;污染菌与生物指示剂耐热性的比较;微生物挑战性试验，用以证明在最短的灭菌周期内在最差条件下(如产品处在生物指示剂最难杀灭的位置或它属于最难灭菌的产品或二者兼备的情况);

2.12 对过度杀灭的风险分析及管理;

2.13 灭菌后的干燥程序对灭菌效果的影响;

2.14研究产品耐受性变更导致的灭菌工艺变化;

2.15总体评价并指导最佳灭菌效果的装载量;

2.16 验证及其相关项目的培训

4.2.3 对于灭菌工艺的验证，应符合以下规定：

1， 保温时间内温度波动应在±0.5℃~±1.0℃之内(环境温度变化变化应尽可能小);

2， 保温时间内压力波动应在±5Kpa之内(若必需);

3， 灭菌工艺验证包含最小装载、饱和装载和典型装载三种;或者采用最大装载，最小装载和混合装载的兼容性研究;

4， 极限最低温度与最大值相差不大于3K;

5， 等效灭菌时间的偏差不大于15s(对最大的灭菌设备不大于30s);

6， 空气过滤器的流速应不大于0.13Kpa/min(若必需);

7， 空气移除速度的检查(若必需，适合多孔/坚硬物质);

8， 生物指示剂的布置;

9， 若必需，则需测被灭菌物品的初始菌(微生物负载);

10， 以冷点为控制温度;即确认所有测点均达到灭菌温度后才计算标准灭菌时间。

5， 灭菌验证形成的相关文件

5.1 相关文件要点

以下是对蒸汽灭菌器或蒸汽-湿热灭菌工艺的相关验证文件的分类，可以根据实际情况作出筛选，但必须评估相关内容是否完整：

灭菌器制造商及其设备信息;

灭菌器的安装报告;

首次灭菌的情况、所有操作及控制文件，包括仪表、阀门、报警装置以及相关设施的校验等;

产品的安全耐受性研究报告

真空度以及压力保障措施的验证

泄漏率测试报告

蒸汽、水、压缩空气等辅助系统的质量测试报告

包含冷点、装载分布、热分布、热穿透等项目研究的IQ、OQ、PQ方案及报告

对验证结果的总结和风险分析，提出装载指导报告

完整的操作记录(也可以是表格)

维护保养程序以及记录，包含预防性维护、条件维护等内容

任何变更、任何故障的处理报告

培训记录以及效果评价报告

再验证周期的规定

其他

5.2 验证文件要点

灭菌参数与被灭菌物品特性的确认

真空度(泄漏率)

蒸汽灭菌的初始菌控制(灭菌前物品的生物负荷的数量)

蒸汽灭菌中对于水、空气过滤器等的要求

产品的安全耐受值

对过度杀灭的限制

挑战试验

再验证周期

新的灭菌工艺的开发

验证实施步骤

偏差处理、风险分析以及验证报告